키랄 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 이부프로펜의 분리도에 관한 실험식

여미순·이윤우1·김재덕1·노경호*

초정밀분리기술센터, 인하대학교, 화학공학과,

한국과학기술연구원, 국가지정 초임계유체연구실*

rowkho@inha.ac.kr

Empirical Equation for Resolution of Ibuprofen Enantiomers

by Chiral High Performance Liquid Chromatography

Mi Soon Yeo·Youn-Woo Lee1·Jae-Duck Kim1·Kyung Ho Row*

Center for Advanced Bioseparation Technology,

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Incheon 402-751

1National Research Lab. for Supercritical Fluid, KIST

rowkho@inha.ac.kr

서론

최근에는 고부가가치 의약품인 키랄 약품을 고순도로 분리하는 기술 개발이 의약 및 정밀 화학 생산공정에 커다란 기술적, 경제적 파급효과를 가져오고 있다[1]. 한 쌍의 거울상 이성질체의 분리를 위해서 광학적으로 활성화된 화합물을 사용하여 원하는 이성질체를 함께 결정화시키는 공정이 사용되어 왔다. 이 공정의 문제점으로는 이성질체를 분리하기 위해 광학 분할 시약을 이용하여 공유결합을 끊어야 하므로 어느 정도 강한 반응조건이 필요하다. 이 경우 광학 이성질체가 라세미화할 위험성이 있기 때문에 응용하기에는 실용적인 가치가 떨어진다. 따라서 광학 이성질체를 분리하기 위하여 키랄 액체 크로마토그래피 (chiral HPLC)가 발전하게 되었다[2]. 현재 chiral HPLC은 광학 이성질체 분리에 가장 중요하게 사용된다. 분리된 피크를 각각 수거하여 두 개의 순수한 광학 이성질체로 분리하여 두 피크의 면적 혹은 높이의 비로부터 광학활성 물질의 광학순도(optical purity)를 측정할 수 있다. 두 광학 이성질체와 키랄 고정상 사이의 상호작용 메카니즘을 정확히 이해하여 용출 순서를 즉시 알 수 있다. Chiral HPLC는 입체화학에 관련된 문제를 해결하는 데 이용될 수 있는 최상의 방법으로 인식되고 있다[3]. 거울상 이성질체는 서로 다른 의약적 활성을 지니고 있는 것으로 알려져 있다[3]. 생산되는 합성 의약품에서 거울상 이성질체 중의 어느 한쪽만이 의약적 효능이 있고 나머지 다른 형태의 거울상 이성질체는 아무런 생리활성을 나타내지 않거나 혹은 각종 부작용의 원인으로 보고되고 있다[4]. 그러나 대부분의 의약품들은 순수한 광학 이성질체만을 포함하는 제품으로 얻는 것이 어렵기 때문에 이성질체들이 혼합된 라세미 혼합물로 사용되는 실정이다. 의약품 생산에 있어서 원하는 순수한 물질만을 얻는 것이 대단히 중요하기 때문에 키랄 약품을 고순도로 분리 및 정제하는 것이 더욱 중요해지고 있다. 라세미 혼합물의 광학적 분리가 어렵지만 부작용을 가져오는 다른 거울 이성질체를 분리하기 위해서는 순수한 한 종류의 광학 이성질체를 얻는 것이 요구되어 진다.

본 연구의 실험 대상 물질인 (R,S)-Ibuprofen[(±)-(R,S)-2-(4-isobutyl phenyl) propionic acid]는 대표적인 비스테로이드 계통의 진통 및 소염제로서 류마티즘, 암 등의 진통제 외에 여러 가지 용도로 널리 사용되는 치료약이며 흔히 라세미 혼합물 상태로 사용되고 있다[4].  S-enantiomer는 약물학적 효과를 갖고 있으나 R-enantiomer는 여러 가지 부작용을 갖고 있다. 따라서 라세미 형태의 이부프로펜을 키랄 고정상으로 채워진 컬럼을 이용하여 이동상의 조성비를 바꿔가면서 이동상의 조성 변화에 따른 두 물질의 분리도의 상관식을 얻는 것이 본 연구의 목적이다.

이론적 배경

분리도 R은 두 피크의 차이와 피크의 평균 폭으로도 정의된다[5]. 체류시간과 피크 폭의 단위가 길이 또는 시간으로 표시되기 때문에 무차원이다.

[eqn: R~ =~ { t_R2 - t_R1 } over {(w_2 +w_1 ) / 2} ~=~ { 2 DELTA t} over {w_2 + w_1 }]	(1)

여기에서 tR2는 S-성분, tR1는 R-성분의 체류시간이며, w1, w2는 각 성분 피크의 기준선에서의 폭이며 시간 단위로 표시한다.

실험에 의한 이동상의 조성과 분리도를 Table 1에 있는 식에 상관하여 다음 correlation coeffcient(r2)를 이용하여 실험식의 타당성을 비교하였다[6].

r2 = [eqn: 1- { SUM{} (y_i -y_est )^2} over {SUM{} (y_i -<y_i > )^2 }],  [eqn: <y_i >] = [eqn: { sum {} {}y_i} over {N }]            (2)

실험

Figure 1은 (R,S)-ibuprofen의 화학적 구조식이다. 실험에서 사용된 표준 시료 물질인 라세미 형태의 ibuprofen은 Sigma Co., 순수한 형태의 ibuprofen은 Aldrich. Co.에서 각각 구입하였고 n-hexane에 1□/□의 농도로 녹였다. 용해된 시료를 일정 용매 조성법을 사용하여 HPLC로 분석하였다. 분석용 column은 3.9×300□ 크기의 stainless column에 Eka Chemicals Inc.의 Kromasil(10□ silica based)을 충진하여 사용하였다. HPLC는 Waters사의 616 pump(multisolvent delivery system), 486 UV-visible tunable wavelength absorbance, 280□, Rheodyne 주입기(20□ sample loop), 데이터 저장 시스템은 Chromate(ver. 3.0, Interface Eng.)를 사용하였다. 이동상은 n-hexane, tert-methyl ethyl ether와 첨가제는 acetic acid를 사용하였다. 유속은 1.0□/min, 주입부피는 5□이고, UV detector의 wavelength는 220□이며 실온에서 실험하였다.

결과 및 토론

이동상 조성의 변화에 따른 체류인자의 변화와 분리도의 변화를 고찰하기 위해서 각각의 조성을 바꿔 가면서 실험을 수행하였다. 키랄 고정상이 실리카 지지체이므로 n-hexane을 기본으로 하였고 첨가제로 acetic acid를, 극성 조절을 위해서 tert-methyl ethyl ether을 사용하였다. 각각의 조성을 바꿔가며 실험하였다.

이동상이 3성분계이기 때문에 hexane을 65∼95vol.%, tert-methyl ethyl ether는 5∼35vol.%로 각기 5%씩 변화시키면서 acetic acid의 함량을 0.02∼0.1vol.% 사이에서 0.02%씩 변화시켰다. 유기용매인 tert-methyl ethyl ether와 acetic acid의 양이 증가함에 따라 체류시간이 짧아지면서 분리 시간이 줄었고 이에 따라 두 피크의 분리도가 감소하였다.

분리도를 이동상 조성에 대한 실험식으로 나타내기 위해서 각 이동상 조성에서의 분리도를 Table 1과 같이 다섯 가지 실험식에 대해서 고려하였다. 이 식들은 보는 바와 같이 각기 이동상의 조성에 대한 분리도의 함수로 상관식을 만들었다. 식 (3)에서는 간단한 선형식으로 구성되었고, 식 (4)에서는 선형식과 상호작용을 고려한 항으로 구성하였다. 식 (5)에서는 2차항까지 확장하였고, 식 (6)는 2차항에 hexane과 tert-methyl ethyl ether의 상호작용이 있는 항으로, 식 (7)에서는 acetic acid(X3)까지 포함하여 선형식과 상호작용이 있는 항을 추가하였다. 각 실험식에 대한 r2를 비교한 결과에 의하면 매개변수의 수가 가장 많은 식 (7)이 1.0000에 가장 근접하였다.

Figure 2는 이동상을 n-hexane/ tert-methyl ethyl ether/acetic acid로 75:25:0.1의 부피 조성비에서 얻은 크로마토그램으로 피크가 완전히 분리되었다. 실험식에 따라서 분리도의 실험값과 잘 맞는 정도를 Figure 3에 표시하였다.

(a) R-form                         (b) S-form

Fig. 1  Chemical structures of Ibuprofen

참고문헌

1. Bhushan, R. and Martens, J.: Biomedical Chromatography 12, 309 (1998)

2. Willie, L.H. and Terrence, E.R.: Anal. Chem. 57, 237(1985)

3. Medvedovici, A., Sandra, P., Toribio, L. and David, F.: J. Chromatography A, 785, 159 (1997)

3. Kim, S.Y., Lee, J.K., Suh, S.S., Choi, M.H., Park, T.J. and Park, D.K.: Hwahak Konghak, 39, 698 (2001).

4. Tan, S.C., Jackson, S.H.D., Swift C.G. and Hutt, A.J.: J. Chromatography B, 701, 53        (1997)

5. Row, K.H.: "Principles and Applications of Liquid Chromatography" (1999)

6. Row, K.H.: "Excel for Chemical Engineering" (2001).

Table 1 Correlation equations for the resolutions of ibuprofen

No.	Equation	r2
(3)	R = 0.9677+0.0691X1-0.0678X2	0.6660
(4)	R = 0.9634+0.0760X1+0.0995X2-0.0028X1X2	0.9334
(5)	R = 1.8937-1.7033X1-0.0177X12+1.5883X2-0.0152X22	0.9480
(6)	R = 5.6186-9.5670X1+0.0960X12-1.5762X2+0.1097X1X2+0.0161X22	0.9551
(7)	R = 0.9407+0.0818X1-0.0033X1X2+0.1409X2+4.8512X3-0.1837X1X3 -2.6518X2X3+0.0351X1X2X3	0.9736

X1 : Hexane (vol.%)

X2 : tert-Methyl ethyl ether (vol.%)

X3 : Acetic acid (vol.%)

`

Fig. 2 Chromatogram of Ibuprofen free acids in isocratic method

(n-Hexane/tert-methyl ethyl ether/acetic acid 75/25/0.1(vol.%), 1ml/min, 5□, 1000ppm)

Fig. 3 Comparison of experimental data with calculated resolutions by Eqs. (3)-(7)