Pelubiprofen의 광학분할을 위한 크로마토그래피 공정에 관한 연구

김소영, 서성섭, 박달근*, 박태진*, 이중기*

한국과학기술연구원 나노환경 연구 센터*, 홍익대학교 화학공학과

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

A Study on Chromatography Process for Optical Separation of Pelubiprofen

So-Young Kim, Sung-Sup Suh, DalKeun Park*,

Tae-Jin Park*, Joong Kee Lee*

Eco-Nano Reserch Center,  KIST*,

Department of Chemcal Engineering, Hongik University

서론

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

한 쌍의 광학 이성질체는 단지 하나의 광학 이성질체만이 의약적 활성을 나타내며 다른 광학 이성질체는 아무런 의약적 활성을 나타내지 않거나 혹은 각종 부작용의 원인이 되는 경우가 많이 보고되고 있다[1]. 일례로 이브프로펜(ibuprofen)의 경우 S-form의 경우는 원하는 소염작용을 하지만 R-form의 경우 부작용을 수반하며, Pemicilamine의 경우 D-form은 류마티즘 치료제로 효과적이나 L-form은 발암성 물질인 것으로 나타났다.    이와 같이 많은 키랄 의약품들이 부작용 등의 문제점을 내포하고 있음에도 불구하고도 대부분의 이성질체들이 혼합된 racemate로 사용되고 있는 실정이다. 이는 의약품을 순수한 광학 이성질체만을 포함하는 제품으로 얻는 것이 어려울 뿐만 아니라 광학활성 의약품들의 광학순도를 정확하게 측정하기가 어려웠기 때문으로 사료된다[2].

Chiral chromatography는 이성질체의 고정상이나 첨가물의 매개체와 분석물질의 상호작용을 이용한 분리방법으로 짧은 시간동안 거울상 이성질체를 부분입체 이성질체로 형성하여 분리를 가능하게 하는 것으로 안정한 착물을 형성할수록 더 분리가 잘 되는 것으로 알려져 있다.

본 연구의 실험대상 물질인 ()-(E)-2-[4-(2-Oxo-cyclohexylidenemethyl)-phenyl]propionic acid, Pelubiprofen은 일본의 Sankyo사에서 개발된 비스테로이드 계열의 진통 및 소염제(NSAID) 이다. 이 물질은 골관절염, 류마티스성 관절염, 근골격성 통증, 수술 후 후유증, 요통, 치통 등과 같은 다양한 종류의 질병치료에 약리활성을 보인다. 또한 이와 유사한 비스테로이드 계열의 소염진통제인 ibuprofen에 비하여서도 매우 높은 약리활성을 가진다는 연구도 보고되고 있다. 그러나 ibuprofen의 경우 이미 합성 뿐 아니라 단일 enantiomer로 분리되어 상용화되고있다. 이에 비하여 pelubiprofen은 현재 세계적으로 그 합성은 보고되고 있지만 단일 enantiomer로의 분리 및 분리정제에 관한 연구는 미비한 실정이다. 더욱이 pelubiprofen은 enantiomer 형식에 따라 매우 다른 약리작용을 보여서 약리활성과 신진대사의 경로에 관한 연구가 중요하게 부각되고 있다[3-4]. 그러므로 본 연구에서는 라세미 화합물을 HPLC를 이용해서 단일 enantiomer로 분리함으로서 그 공정의 단순화 및 상용화를 위한 기초자료를 얻는 것이 목표이며, 이러한 자료의 축적은 추후 실 공정의 모사에 중요한 자료를 제공할 것으로 기대된다.

실험

본 실험에 사용된 HPLC의 칼럼은 Kromasil□충진제(Eka chem . ,Sweden)를  내경이 4.6mm, 길이가 250mm인 stainless-steel 칼럼(Alltech)에 슬러리 팩킹하여 사용하였다. Kromasil□에 사용된 슬러리 용매는 methanol/acetone[50/50,v/v%] 혼합물이었고, 가압 용매로는 methanol을 사용하였다. 실험에 사용한 이동상 용매는 hexanes[95% n-hexane], tert-butyl methyl ether[99.8%,HPLC grade, Aldrich Chmical Co.], acetic acid를 사용하였다. 실험에 사용된 (±)-(E)-2-[4-(2-Oxo-cyclohexylidenemethyl)-phenyl]propionic acid (이하 pelubiprofen)은 대원제약에서 제공받은 것을 사용하였다.

실험에서 사용한 실험장치는 고압펌프 (Young-Lin M930), injection system (syringe+sample loop), gradient mixer (Waters), UV spectrometer (Young-Lin M720), data aquisition (Young-Lin, Autochrowin)로 나눌 수 있다. 시료의 주입은 0.05ml 주사기를 사용하였고, 이동상의 흐름을 조절하기 위해 HPLC 펌프를 사용하여 이동상의 흐름을 1.0∼5.0ml/min까지 변화시키면서 실험하였다. 이동상에서는 hexane/ tert-butyl methyl ether/ acetic acid의 조성비를 75/25/0.1, 70/30/0.1, 65/35/0.1, 60/40/0.1, 55/45/0.1, 50/50/0.1(v/v%)로 변화를 주면서 적절한 이동상의 조성비를 찾는 실험을 하였고 주입시료의 농도가 분리도에 미치는 영향을 확인하기 위해 주입시료의 농도를 바꿔가면서 실험을 하였다.

유출되는 성분은 UV detector의 adsorbance값이 260nm에서 검출한 뒤 검출한 뒤 데이터 모듈에 연결되어 모듈에서 PC로 데이터를 전달하여 peak의 면적과 높이, retention time 등을 얻을 수 있다.

본 연구의 실험에서 얻은 분리결과를 정량적으로 표현해 주기 위해서 분리도(resolution), 이론단수(the number of theoretical plates), HETP(height equivalent to a theoretical plate), 용량인자(Capacity factor)를 정의하여 사용하였다.

분리도(R)은 두 물질간에 분리 정도를 나타내며 아래의 식으로 정의된다. 체류시간과 peak 폭의 단위가 길이 또는 시간으로 표시되므로 분리도는 무차원이 된다.

[eqn: R~=~{t sub{2}~-~t sub{1}} over {{(w sub{2}~+~w sub{1})}/2}~=~{2△t} over {w sub{2}~+~w sub{1}}]            ( 1 )

t1, t2는 시료 1, 2의 체류시간이며, w1, w2은 시간단위로서 peak 1, 2의 기준선에서의 폭이다.

[eqn: k'= { t_R- t_0} over {t_0 }]                            ( 2 )

tR은 용질의 칼럼 안의 체류시간, t0는 고정상과 상호작용이 없는 물질의 체류시간(dead time)이다. 칼럼의 효율은 baseline에서 측정한 peak의 폭(w)을 이용한 다음 식에 의해서 계산하였다.

[eqn: N = ( { t_R} over { sigma })^2 = 16 LEFT ( { { t_R} over {w } }RIGHT ) ^{2 }]                ( 3 )

□는 표준편차이고, 실험에서 얻은 peak로부터 N값을 구하고 column의 길이 L을 알면 다음과 같은 관계식으로부터 HETP(H)를 구할 수 있다. HETP는 관내의 충진물과 시료에 대한 관의 효율을 나타낸다. HETP는 이동상의 유속, 이동상의 조성, 관의 온도, 시료의 주입량 및 관의 크기와 같은 실험변수에 의해 주로 영향을 받는다.

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

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[eqn: H = {L } over {N }]                              ( 4 )

Theories and Application of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

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결과 및 고찰

고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 라세미 pelubiprofen의 분리하기 위해서 가장 중요한 것은 분리도와 분리시간이고 낮은 HETP를 갖도록 조업조건을 설정하는 것이 고순도 분리를 위한 전제 조건이 된다. 본 연구에서는 고부가가치를 갖고 있는 거울상 이성질체 의약품인 라세미 pelubiprofen을 키랄 고정상법을 이용하여 단일 enantiomer로 광학분리하기 조업 조건을 찾기 위한 실험을 수행하였다.

라세미 pelubiprofen을 분리하기 위한 이동상의 조성비를 찾기 위해서 고정상은 Kromasil□을 slurry packing한 칼럼을 사용하고 주입부피는 5□로 고정시킨 후 이동상의 유속은 1ml/min으로 흘려 보내면서 hexane/tert-butyl methyl ether/acetic acid의 조성비를 75/25/0.1, 70/30/0.1, 65/35/0.1, 60/40/0.1, 55/45/0.1, 50/50/0.1 (v/v%)로 변화를 주면서 실험해 보았다.

Fig. 1. Chromatogram of S-pelubiprofen and R-pelubiprofen

at various mobile phase compositions.

Injection concentration of 1000ppm in tert-BME, injection       volume of 5□.

이동상의 조성비가 라세미 pelubiprofen을 분리하는데 미치는 영향을 파악하기 위해  그 결과를 Fig. 1의 크로마토그램으로 비교해 놓고 분리도를 계산하여 Fig. 2에 나타내었다. 두 개의 결과 그래프를 비교해 본 결과 hexane의 양이 증가할 수록 분리도가 증가하고, 분리시간은 길어졌다.

반면에 tert-butyl methyl ether의 양이 증가하면 분리도가 감소하고, 분리시간이 짧아지는 것을 확인 할 수 있었다. Fig. 3에는 이동상의 조성비에 따른 capacity factor(k)를 나타내었는데 hexane의 양이 증가할수록 capacity factor(k)가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 2. Effects of mobile phase compositions on resolution.

Injection concentration of 1000ppm in tert-BME for

the optical separation of pelubiprofen injection volume

of 5□.

Fig. 3. Effect of mobile phase composition on retention           time of S-pelubiprofen and R-pelubiprofen, respectively

Injection concentration of 1000ppm in tert-BME,

injection volume of 5□

분석시료의 농도에 따른 영향을 살펴보기 위해서 농도를 0.0005∼0.005g/ml까지 증가시키면서 실험한 결과 분석시료의 농도가 증가하면 체류시간은 거의 일정 하지만 분리도는 농도가 증가할수록 분리도가 떨어지는 것을 알 수 있다. Fig. 4과 Fig. 5은 각각 S-pelubiprofen과 R-pelubiprofen에 따른 HETP값을 나타내었는데 시료의 농도가 증가할수록 시료의 양이 많아지게 되고 peak의 면적이 커지면서 peak의 폭도 커져 HETP 값도 증가하게 된다.

Fig. 5. Effects of input concentrations on HETP of

R-pelubiprofen. Injection volume of 10□.

Fig. 4. Effects of input concentrations on HETP of

S-pelubiprofen. Injection volume of 10□.

참고문헌

[1] 현명호: □LC에 의한 광학 이성질체의 분리□, 민음사, Seoul, Chapter 2(1996)

[2] Yoshio, O., Ryo, A., Kazuhiro, H. and Koichi, H.: J. of Chromatography B.: 53,        701, (1997)

[3] Masato, A., Wataru, T., Haruo I., Hideyuki, H., Kazuyuki, W., Atusuke, T.,           Yorihisa. T.: Biol. Pharm. Bull.: 18(11), 1584-1589, (1995)

[4] US pantent 4,365,076