고체배양을 이용한 Beauveria bassiana CS-1의 conidia 생산

이성훈, 강성우, 윤철식, 홍석인, 김승욱

고려대학교 화학공학과

Conidia production of Beauveria bassiana CS-1 in solid-state fermentation

Sung-hun Lee, Sung-woo Kang, Chul-sik Yoon, Suk-in Hong, Seung-Wook Kim

Department of Chemical Engineering, Korea University,

서론

화학농약이 지니고 있는 환경오염이나 비특이적인 살충효과 등의 문제점들을 해결할 수 있는 대안으로 곤충병원성 미생물을 이용한 미생물 살충제의 연구가 꾸준히 진행되고 있으며, 몇몇 나라에서는 상품으로 생산되고 있다. 미생물 살충제의 대량생산을 위해 고체배양에서의 포자생산과 관련하여 배양조건의 최적화와 생물반응기의 도입을 위한 기초실험을 하였다.

이론

1. Beauveria bassiana CS-1은 배추좀나방에 대한 살충력이 매우 뛰어난 것으로 알려져 있으며, 이를 이용하여 미생물 살충제를 대량생산하기 위한 방법으로는 고체배양이 가장 적합하다. 고체배양(SSF, solid-state fermentation)은 고체기질 입자 사이에 visible water(free water)가 없는 상태에서 미생물이 고체기질이 함유하고 있는 수분과 영양분을 이용하여 성장하는 것을 말한다. 고체배양은 액체배양에 비하여 곰팡이 포자생산에 있어서 높은 생산성을 나타내며, 생산된 포자의 활성 및 상품성이 뛰어난 것으로 보고되고 있다.

2. 고체배양은 액체배양과는 전혀 다른 메카니즘을 지니고 있으므로 이를 이용한 포자의 대량생산을 위해서는 액체배양과는 다른 방향에서의 접근이 필요하다. 고체배양의 방법으로는 open tray, closed tray, poly-vinyl bag 등이 널리 이용되고 있으나, 대량생산을 위한 생물반응기로서는 부족한 면이 있다.

실험

1. 균주

Beauveria bassiana CS-1을 사용하였으며, 한 달 간격으로 계대배양하였다.

2. 액체종균배양

사면배지로부터 얻은 포자 현탁액을 250 ml 삼각플라스크에서 2%(w/v) glucose,        1%(w/v) bacto peptone 을 함유한 100 ml 배지에 접종하였다. 25℃, 200rpm    으로 5일간 shaking incubator에서 배양하였다.

3. 고체배양

볏짚 3g, 밀기울 7g의 고체배지에 증류수 20 ml을 첨가하여 액체종균배양액      1 ml를 접종하였다. 7일간 25℃에서 배양 후 24시간 동안 50℃에서 건조하여       hemocytometer로 분석하였다.

결과 및 토론

1. Open tray와 closed tray 비교 실험

고체기질층의 높이를 3cm로 고정시킨 후 두 가지 종류의 tray에서 conidia 생    산량을 삼각플라스크와 비교하였다.

Table 1. Conidia produntion in flask, open and closed trays.

Reactor	conidia conc. (conidia/substrate g)
flask	1.824
open tray	1.862
closed tray	0.00075*1010

open tray의 경우 flask와 비슷한 수준으로 conidia가 생산되었으나 closed       tray의 경우에는 거의 생산되지 않았다. 이는 conidia 생산에 있어서 산소의      공급이 중요한 요소임을 증명하고 있다.

2. Packing density의 효과

column reactor에서 고체배지의 packing density(kg/L)에 따른 conidia의 생산    량을 조사하였다(Fig.1).

Fig . Effect of packing density on the                 production of conidia

Fig . Effect of bed height on the production         of conidia

고체기질층의 packing density가 증가하면서 conidia 생산량 크게 감소하는 것    을 볼 수 있다. Packing density가 증가하게 되면 미생물이 성장할 수 있는 공    간이 부족할 뿐만 아니라 산소의 공급과 이산화탄소의 제거에도 어려움이 생    기게 된다. Column에서의 실험결과는 open tray나 다른 형태의 생물반응기에    도 적용이 가능하며 이를 통해 대량생산을 위한 생물반응기에서 고체배지의     packing density를 조절하는 중요한 요소임을 알 수 있다.

3. 고체기질층의 높이에 따른 conidia의 생산량 변화

Fig.2를 보면 고체기질층의 높이에 따라 conidia의 생산량에 큰 변화가 없는     것을 알 수 있다. Packing density는 0.4kg/L로 고정하였으며 실험에 사용된     컬럼의 내경은 1.5cm이다. 기존의 논문들과 달리 고체기질층의 높이에 따른 변    화가 없는 이유는 packing density가 낮아 미생물이 성장하기에 어려움이 없었    으며 내경이 작아 반지름 방향으로의 열전도가 충분히 일어나 컬럼 내에 과열    현상으로 인한 conidia의 생산량 저하도 없었기 때문이다. 그러나 하루 처리량    이 1-10톤 규모인 대량생산 공정에서는 tray reactor를 사용할 경우 고체기질    층의 높이에 따른 packing density의 증가를 피할 수 없으며, 따라서 conidia의    생산량도 현저히 감소할 것이다. 대량생산을 위해서는 packed-bed reactor나     rotating drum reactor등의 가능성에 관한 실험이 요구된다.

4. Heat shock 효과

고체배지에 접종 후 각각 배양 3, 4, 5일 째에 배양 온도를 25℃에서 28℃로     바꾸어주었다.

Table 2. Effect of heat shock on the production of conidia

Condition	conidia conc. (conidia/substrate g)
No temperature shift	1.72*1010
Temperature shift on 3rd day of cultivation	0.12*1010
Temperature shift on 4rd day of cultivation	0.49*1010
Temperature shift on 5rd day of cultivation	1.37*1010

온도변화가 없는 플라스크에 비해서 모두 conidia의 생산량이 크게 감소하는     것을 관찰할 수 있다. Heat shock을 주는 시간이 빨라질수록 conidia 생산량     의 감소량은 더욱 커졌다. 이를 통해 배양 기간 내에 배양온도가 25℃로 일      정하게 유지되어야 하며 생물반응기내의 온도 증가는 conidia의 생산량에 큰     영향을 미치는 것을 알 수 있다. Scale-up을 할 경우 미생물로부터 발생되는     발열량이 증가하게 되므로 이로 인한 생물반응기내의 과열 문제를 해결해야     대량생산이 가능할 것이다.

5. 접종량에 따른 conidia 생산량 변화

conidia 대량생산 공정에서는 고체배지에 접종하는 액체종균 배양액의 부피도증가할 것이다. 따라서 액체배양을 위한 시설비와 유지비가 큰 부담이 될 수 있으며 이를 최적화하는 것은 미생물 살충제의 생산단가를 낮추는 데 매우 중요하다. 접종량을 1ml, 2ml, 3ml로 변화시키면서 conidia의 생산량을 살펴보았다.

Fig. Effect of inoculum size on the               production of conidia.

감사의 글

본 연구는 농업진흥청의 농업특정연구과제 연구비로 수행되었으며, 연구비 지원에 감사드립니다.

참고문헌

1. McQuiken, MP, Budge, SP and Whipps, JM. : Mycol. Res., 101, 11-17(1997)

2. Smits,A. Rinzema , J. Tramper , Sonsbeek , W. Knol : Appl. Microbiol.         Biotechnol., 46, 489-496(1996)

3. S. Rajagopalan , J.M. Modak : Bioprocess Engineering, 13, 161-169(1995)

4. T. Roukas : Appl. Microbiol. Biotechnol., 41, 296-301(1994)