Chirex□ HPLC에서 ketoprofen의 분리

윤태호, 조대희, 김인호

충남대학교 화학공학과 생물신소재연구실

Separation of ketoprofen in Chirex□ HPLC

T. H. Yoon, D. H. Cho and I. H. Kim

Bio-process Laboratory, Department of Chemical Engineering, Chungnam National University, Daejeon, 305-764

서론

천연계에 존재하는 대부분의 생체 구성물질들은 광학적으로 거울상을 가진 광학 이성질체로 존재하고 있으며, 특정 화합물은 생체내에서 서로 다른 역할을 수행한다(1).  이러한 광학 이성질체를 chiral 화합물이라 하며, 거울상으로 대칭인 구조를 가지고 있으므로, 임의의 방법을 통하여 서로 일치되는 입체구조를 갖도록 할 수 없다(2).  이러한 chiral 화합물중에서 현재 몇몇의 물질들은 의약품 원료로서 광이성질체의 분리에 대한 관심도가 증가하고 있으며, 범용적이면서도 FDA의 승인을 받아 수년 이내로 산업화가 될 것으로 예상되는 프로펜류 의약품을 대상으로 분리 기술의 발전이 시급한 단계이다.  현재는 chiral 화합물의 분리를 수행하기 위한 chiral 고정상이 개발되어 시판되고 있으며, 기존의 효소를 이용한 합성방법에 비하여 크로마토그래피를 이용한 분리공정이 개발되고 있다(3).

본 연구는 ketoprofen중에서 광학적으로 활성을 갖는 S-ketoprofen을 효과적으로 분리하기 위한 필요조건으로 각 enantiomer들의 등온 흡착곡선을 계산하여 생산 규모의 공정에 적용하기 위한 조업 조건의 최적화를 수행하고자 한다.

이론적 배경

등온흡착곡선을 구하는 방법으로 컬럼의 입구에서 용질의 농도를 계산함수적으로 증가시켜 용출되는 크로마토그램의 응답에 의해 계산할 수 있으며, dynamic method중의 frontal analysis와 pulsed input method 등이 있고, 이를 이용하여 Langmuir 등온 흡착 곡선을 구할 수 있다(4).

[eqn: &bar C_A ``=`` {N K_A } over {1 `+` K_A C_A `+` K_B C_B } ~~~~~~~~~~~~~~~ (1) #&bar C_B ``=`` {N K_B } over {1 `+` K_A C_A `+` K_B C_B } ~~~~~~~~~~~~~~~ (2)]

여기서, [eqn: &bar C ``=`` 고정상의 농도, ``C ``=`` 이동상의 농도,`` N ``=`` 이론~ 최대~ 흡착량, #&K``=``Langmuir~ i sotherm의~ 평형상수,`` A,`B`=`성분]

재료 및 방법

1. 실험재료

본 실험에 사용한 ketoprofen(국전시약)은 라세미 혼합물로 시판되고 있는 특급시약을 사용하였으며, 이동상으로 사용한 메탄올은 Merck사의 HPLC급으로 구입하였다.  또한, 첨가제로써 ammonium acetate(Hayashi Pure Chemical Industry, Japan)를 사용하였다.

2. 실험장치

본 실험에 사용한 HPLC는 용매 이송펌프(M-930, Young Lin, Korea), UV 검출장치(M-720, Young Lin, Korea)에 시료 주입장치(Lot. 4995, Rheodyne, USA)에 필요에 따라 각각 20, 100, 5000□의 sample loop를 부착하였다.  또한 칼럼은 Chirex column□(4.6mm ×250mm, P-No. 3005, Phenomenex, USA)으로 칼럼내에 R-형의 naphthylglycine과 3,5-dinitrobenzoic acid가 실리카에 공유결합되어 충진되어 있으며, column heater(CH-30, Eppenforf, USA)의 내부에 장착하여 일정한 온도에서 실험을 수행하였다.

3. HPLC 운전조건

HPLC의 조작 유속은 0.5ml/min으로 조절하였으며, ketoprofen의 농도는 각각 0.5□/□에서 50□/□까지 농도로 메탄올에 용해시켜 실험을 수행하였다.  칼럼의 온도에 따른 크로마토그램의 변화를 보기 위하여 각각 30℃, 35℃, 40℃ 그리고 45℃로 칼럼 히터의 온도를 변화시켰다.

실험결과

1. 이동상의 조성에 따른 분리도의 변화

Ketoprofen의 분리에 최적화를 수행하기 위하여 이동상에 첨가하는 ammonium acetate의 농도를 10mM에서 80mM까지 변화시켰으며, 이동상의 유속은 0.5□/min이었고, 칼럼온도는 30℃를 유지하였다.  각각의 경우에 대한 크로마도그램을 Fig. 1에 나열하였다.

이동상중에 포함된 ammonium acetate의 농도가 상승할수록 ketoprofen의 체류시간도 단축되었으며, 50mM의 경우에서 분리도(□=k1/k2)값이 1.087로 가장 좋은 분리도를 보였다.  또한, 이동상으로 순수한 methanol을 사용하였을 경우, R-, S-ketoprofen의 분리가 일어나지 않았고, ammonium acetate의 양을 80mM 이상으로 높인 경우, 분리시간은 14분 이내로 단축할 수 있었으나, 분리도가 감소하는 현상을 보였다.  따라서, 가장 높은 분리도를 보인 이동상인 50mM ammonium acetate 농도의 methanol을 사용하였다.

□=1.075            □=1.076             □=1.087       □=1.085

A.A=20mM        A.A=30mM          A.A=50mM     A.A=80mM

Fig. 1. Chromatograms of ketoprofen at various ammonium acetate con- centraion in methanol (A. A= ammonium acetate concentration, flow rate=0.5□/min, sample loading amount=20□, temperature=30℃, wave length=254nm).

2. 칼럼 온도에 따른 분리도의 변화

칼럼의 온도를 30℃에서 45℃까지 변화시켜 크로마토그램의 변화를 살펴보았다.  칼럼의 온도가 상승할수록 이동상의 점도가 감소하여 ketoprofen의 체류시간도 단축되었으나, 45℃이상으로 칼럼의 온도를 상승시켜도 30℃의 경우에 비하여 5%이내의 편차를 보여 HPLC 조업온도는 40℃로 결정하였다.

3. Frontal analysis를 이용한 ketoprofen의 등온 흡착곡선 추산

칼럼의 고정상에 흡착된 양을 계산하기 위하여 frontal analysis를 수행하였다.  고정상과 이동상간에 충분한 평형이 이루어지도록 시료 주입장치에 5000□의 sample loop를 장착한 후, 각기 칼럼의 설치한 경우와 설치하지 않은 경우 다른 용출곡선을 얻었다.  이동상의 유속은 50mM ammonium acetate 농도의 methanol을 0.5□/min로 하였으며, 칼럼 온도는 40℃를 유지하였다.  크로마토그래피 칼럼을 장착하지 않은 경우는 이동상의 이동에 의한 매우 급격한 농도 분포를 보이며, 폭 넓어짐 현상이 없는 이상적인 크로마토그램에서와 같은 직사각형 형태를 보이게 된다.  칼럼이 장착된 경우는 칼럼내에서의 축방향 분산등에 의한 폭 넓어짐 현상이 일어난다.  칼럼내에 존재하는 전체 용질에서 용액중에 포함된 용질의 양을 빼면 고정상에 흡착된 용질의 양을 계산할 수 있으며, 이와같이 칼럼의 존재 유무에 따라 얻어지는 크로마토그램을 통하여 고정상에 흡착된 ketoprofen의 흡착량을 계산하였다(Table 1).  또한, 시료의 농도가 증가하여도 분리도(□)는 거의 일정한 값을 유지하므로, Langmuir equation(식 (1),(2))에 적용하여 등온 흡착곡선을 구할 수 있었다(Fig. 2).

Table 1. Adsorption isotherm data of ketoprofen.

CR=CS(□/□)	[eqn: bar C_R](□/□)	[eqn: bar C_S](□/□)	□
0.25	2.1	2.2	1.05
0.5	4.0	4.2	1.05
2.5	17.1	17.9	1.04
5	29.8	31.2	1.05
15	54.5	55.5	1.04
25	69.9	73.1	1.05
CR, CS = concentrations of R- and S-ketoprofen in mobile phase [eqn: bar C]R,[eqn: bar C]S = concentration of R- and S-ketoprofen in stationary phase

Fig. 2. Langmuir isotherm of R-,

S-ketoprofen

결론

Ketoprofen을 분리하고, 등온 흡착곡선을 구하고자 HPLC에 CSP(chiral stationary phase)를 사용하여 실험을 수행하였으며, 이동상에 포함된 ammonium acetate의 농도가 50mM 일 경우 가장 좋은 분리도를 보였다.  또한, 칼럼의 온도에 대한 영향을 15℃이내에서 5%이내의 편차를 보여 온도에 의한 분리도의 향상은 기대하지 못했다.  Frontal analysis를 통하여 각각의 enantiomer에 대한 고정상의 흡착량을 계산한 후, 등온 흡착곡선을 구할 수 있었다.

참고문헌

1. Wainer, I. W. and Drayer, D. E.: "Drug stereochemistry, Analytical methods and pharmacology", Marcel Dekker Inc., New York & Basel (1988).

2. Zief, M. and Crane, L. J.: Chromatographic science series, 40, 91, (1988)

3. Francotte, E. R. and Richert, P.: J. Chromatogr. A, 769, 101 (1997).

4. Choi, Y. S, Lee, J. W. and Row, K. H.: HWAHAK KONGHAK, 38, 4, 474, (2000).