유전자 치료를 위한 lenti vector 생산의 최적화 연구

오덕재

세종대학교 생명공학과

Optimization of lenti vector production for gene therapy

Duk Jae Oh

Department of Bioscience and Biotechnology, Sejong University

서론

A형 혈우병은 남자 5000명중에 한명의 환자가 발견되는 빈도의 유전병으로, 혈액응고인자인 factor VIII (FVIII)의 유전자에 이상이 생겨 나타나게 된다.  현재까지 이러한 혈우병에 대한 치료법으로 사용되고 있는 것은, 혈액을 수집한 후 분리한 플라즈마로부터 FVIII을 정제하거나 재조합 단백질인 rhuFVIII을 생산하여 환자에게 출혈이 시작되거나, 출혈을 동반하는 수술 등이 시술되기 전에 환자의 혈관에 주입하는 것으로, 지속적으로 치료되어야 하고, 혈액으로부터 유래된 각종 질병에 환자가 감염될 가능성이 높으며, 경제적으로도 환자에게 부담이 되는 치료법이다.  이같은 치료법을 대체하고 영구적인 치료효과를 달성하기 위하여, 손상된 유전자를 대신하여 FVIII을 생산할 수 있는 정상적인 유전자를 삽입하는 유전자치료 연구가 진행되어 왔으며, 유전자 삽입의 효율성이 높은 유전자 운반용 매체로 바이러스를 널리 이용하게 되었다. 이에따라 retro, adeno, adeno-associated virus (AAV) 및 HIV에서 유래된 lenti 바이러스가 벡터로 개발되었다.  본 연구에서는 A형 혈우병의 유전자치료를 위해 개발된 lenti 바이러스 벡터 (lenti-FVIII)의 생산을 위하여 transient trasfection법, 특히 Ca-phosphate와 plasmid DNA와의 결합침전물을 이용하는 방법을 사용할 때, 생산성을 향상시키기 위한 방법을 탐색하였고, 이를 최적화하는 연구를 실행하였다.

실험

Lenti 벡터의 제조를 위해 4가지의 plasmids (packaging, envelope, rev 및 transfer gene을 각각 포함)를 사용하였고, Ca-phosphate와 plasmid DNA의 결합침전물을 이용하는 transient transfection법을 사용하였다.  벡터를 생산하게 되는 세포주로 293 및 293T를 사용하였고, 이들이 생산한 벡터의 transducing activity를 측정하기 위하여 HeLa 세포주를 이용하였다.  세포배양 및 바이러스 벡터의 생산은 10%로 혈청(FBS)을 첨가한 IMDM 배지에서 실행하였다.

결과 및 고찰

293 또는 293T세포와 Ca-phosphate/plasmid DNA 침전물과 접촉하는 시간은 세포의 lenti벡터 생산에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었고, 벡터생산시의 온도, 생산된 벡터의 회수시점, 벡터생산촉진제의 첨가 등에 의하여 생산성을 획기적으로 향상시킬 수 있었다.

Figure 1. Time courses of lenti vector production from 295T (top) and 293 (down) cells.  Effect of cell densities and transfection methods were examined.  Experiments were carried out using 10 cm (diameter) cell culture plates.

Figure 2. Effects of temperature and envelopes on lenti-FVIII vector production from 293T cells (top), and temperature and elicitors on lenti-GFP vector production from 293 cells (down).  Sodium butyrate and chloroquine were tested as elicitors for lenti vector production.

Figure 3. Effect of elicitors (top) and multiple transfection (down) on production of lenti-GFP vector from 293 cells.  Polybrene and beta-mercaptoethanol were test for elicitors.