Saccharomyces cerevisiae를 이용한 ceramide의 HPLC 분리

(Ⅰ) 세포 배양조건의 확립

김세경↗· 강덕희· 윤현식↗· 노경호

인하대학교 화학공학과,↗생물공학과

HPLC Separation of Ceramide by Saccharomyces cerevisiae (Ⅰ) Setup of Cell Culture Conditions

Se Kyung Kim↗· Duk Hui Kang·Hyun Shik Yun↗·

Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., ↗Dept. of Bio. Eng., Inha University,

Inchon 402-751, Korea

서론

피부보호기능을 하는 각질층의 세포간 지질 조성물은 ceramide 40%, 콜레스테롤이 25%, 지방산이 25%, 콜레스테롤 솔베이트가 10%로 구성된다. Ceramide는 각질층의 수분의 손실방지와 손상된 피부 보호층을 복원하는 중요한 성분으로 알려져 있다. 두겹의 캡슐형상으로 되어있는 ceramide는 그 내부에 포함되어있는 수분과 영양분을 빠른 속도로 목적지에 운반해 가는 성질이 있으며, 그 침투성도 다른 성분과 비교할 수 없을 만큼 뛰어나다고 알려져 있다.[1]

최근에는 yeast에서 생산하는 sphingolipids에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.[2] Yeast는 상대적으로 빠른 성장, 비유독성 그리고 발생적으로 조종될 수 있는 능력때문에 ceramide의 생산을 위해 적합한 것으로 알려져 있다.[1] 그럼에도 불구하고, yeast에 의한 ceramide의 생산 그리고 그 양에 대한 정량적인 실험결과는 아직 확실히 알려진 것이 없다. 현재까지 생산되는 ceramide는 단지 두 종류의 yeast, Saccharomyces cerevisiae와 Torulopsis(Candida) utilis에서만 발견되고 있다.[1]

Yeast에 의한 ceramide의 생산 그리고 그 양에 대한 정량적인 실험결과를 얻기 위해서 정상 HPLC를 이용하여 실험하였다. 정상 HPLC 시스템은 유기용매를 기본용매로 사용하고 메탄올이나 이소 프로필 알코올등을 부가적으로 사용한다. 빠르고 정확한 지질의 구성을 알기 위해서 정상 HPLC-ELSD를 사용한 연구가 진행중이다.[3] 본 연구에서는 Ceramide의 원물질인 sphingolipid를 생산하는 yeast의 한 종류인 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 ceramide를 직접 생산하고 정상 HPLC를 사용하여 주입양과 순도를 더욱 높게 하는 것이 연구의 목적이다.

실험 방법

1. 균주 및 배양

본 연구에서 사용한 균주는 sphingolipid를 생성하는 것으로 알려진 Saccharomyces cerevisiae (KCCM 50515)이다. 균주의 활성을 유지하기 위하여 두 주일 단위로 평판배지에 계대배양한 후 4℃ 냉장고에서 보관하면서 접종용 균주 배양에 사용하였다. 균주 배양을 위한 배지는 YEPD medium으로 그 조성은 glucose, 20g/L; bacto peptone, 20g/L; yeast extract, 10g/L 이었다. 배양 조건은 250mL erlenmeyer flask내에 배지 50mL를 주입, 접종한 후 회전식 진탕 배양기를 사용하여 배양 실험을 수행하였다. 작동 온도는 30℃, 회전수는 200rpm이었으며 배양 시간은 48시간이었다.

2. Lipid 회수

생성된 lipid는 원심분리 방법과 ultrasonification 방법을 이용하여 추출하였다. Saccharomyces cerevisiae를 배양한 후, 회수한 배양액을 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배지성분을 제거하고, 증류수로 두 번 washing하여 균체만 채취하였다.

3. Lipid 추출

5g(wetweight)의 yeast균체에 20mL chloroform - methanol (1:2, v/v) 용액을 첨가한 후 sonicator(IKA U200S)로 5분씩 세 번 sonication 하였다. sonication한 샘플은 0.2□ RC filter(Sartorius)로 filtering 하였다. 여과되지 않고 남은 균체는 다시 50mL의 chloroform-methanol(2:1, v/v) 용액을 첨가하여 상온에서 30분동안 stirring 한 후 다시 filtering 하는 과정을 4번 반복하였다. 회수된 샘플용액은 solvent evaporation 하여 건조하였다.

4. Ceramide의 분리, 정제

건조된 total lipid는 sphingolipid를 획득하기 위해 mild alkaline hydrolysis 방법을 수행하였다. 건조된 lipid sample을 methanol-carbontetrachloride(5:1, v/v) 용액에 녹인 후 0.2M의 methanolic NaOH를 동량 첨가하여 상온에서 한시간 동안 alkaline hydrolysis를 하였다. 그 후 0.8배의 증류수를 첨가하여 교반한 후 1M의 acetic acid로 중화시켰다. unsaponified lipid를 chloroform으로 추출하였다.

5. 정상 HPLC-ELSD

HPLC 시스템으로는 Waters 600s Multisolvent Delivery System이 부착된 Waters 616 liquid chromatography (Waters Associates, Milford, MA, U.S.A.), 그리고 Rheodyne injector (20□ sample loop)이 사용되었다. 데이터 수집은 Millennium 32 (V. 3.05, Waters, U.S.A)가 PC에 install 되었다. ELSD의 drift temperature는 65℃이며, gas flow rate는 1.6ml/min이였다. 이동상으로는 클로로포름, 그리고 메탄올이 사용되었다. HPLC용 column(Licroprep Si 60 15□, 3.9×150mm)은 진공 펌프를 이용하여 채웠다. 이동상의 유속은 1.0ml/min으로 고정되었다.

결과 및 고찰

Ceramide의 원물질인 sphingolipid를 생산하는 yeast의 한 종류인 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 ceramide를 직접 생산하고 제조용 정상 HPLC를 사용하여 ceramide의 존재여부를 확인하였다.

셀 배양후의 추출물은 불순물이 많이 포함되어 있으므로, ACRODISC CR PTFE 0.45□를 이용하여 필터링을 하였다. 필터링한 용액을 일정 용매 조성법을 사용하여 HPLC에 주입을 하였다. 일정 용매 조성법으로는 ceramide의 존재여부를 확인 할 수 없었다(Fig1). ceramide의 구조내에 있는 free fatty acid의 극성 혹은 비극성 성질 때문에 일정 용매 조성법으로는 분석시간이 길어졌다. 구배 용매 조성법으로 이동상의 극성을 조금 높여 줌으로써 보다 빠르게 분석할 수 있었다(Fig3). 메탄올의 조성은 분석을 시작할때에 3 vol.%에서 3분까지 70 vol.%으로 변화를 주고 다시 8분까지 100 vol.%으로 변화하였다. 각각의 단계에서는 선형적인 변화를 주었다(Fig3). 피크의 면적을 비교함으로써 셀 배양후의 추출액에는 약 3%의 ceramide가 존재함을 알 수 있었다.

참고문헌

1. Rupeic, J., Mesaric, M., and Maric, V., Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 583 (1998)

2. Dickson, R. C., and Lester, R. L., Biochimica et Biophysica Acta., 1426, 347 (1999)

3. Norlen, L., Nicander, I., Lundsjo, A., Cronholm, T. and Forslind, B., Arch Dermatol. Res., 290, 508 (1998)

Fig. 1 Chromatogram of cultured cell extraction solution using NP-HPLC with ELSD eluted in isocratic method

Fig. 2 Chromatogram of cultured cell extraction solution using NP-HPLC with ELSD eluted in gradient method