수정진동자 미량분석기를 이용한

Immunoreaction environmental sensor의 개발

박 종원, 黑澤 茂, 愛澤 秀信, 中村 史, 三宅 淳, 吉本 稔, 손 세영*, 장 상목*

日本産業技術總合硏究所, 동아대학교 화학공학과*

Immunoreaction environmental sensor using quartz crystal microbalance

Jong-Won Park, Shigeru Kurosawa, Hidenobu Aizawa, Chikashi Nakamura,

Jun Miyake, Minoru Yoshimoto, Se-Young Son*, Sang-Mok Chang*

AIST, Dong-A University*

서론

다이옥신으로 인한 환경오염문제는 전세계적으로 심각한 문제가 되고 있다. 환경중에 배출된 다이옥신은 식품, 피부접촉, 대기, 음용수 및 토양등의 매개체를 통하여 인간의 건강과 생태계에 악영향을 미치고 있다. 이러한 다이옥신을 규제하기 위한 세계각국 정부의 환경 기준법이 점점 엄격해짐에 따라 환경오염정도를 분석할 고감도의 분석방법이 요구되어지고 있다. 최근, 다이옥신을 검출하기위해 가장 선호되어지고 있는 방법은 gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)[1-3]등과 같은 방법이 가장 일반적으로 사용되어지고 있다. 그러나, 이와같은 방법은 시료의 전처리와 시료의 분석에 많은 시간이 소모되므로 빠른시간에 시료를 분석하는 것은 불가능하다. 또한, 일반 실험실에서 다이옥신을 직접적으로 취급하는 것은 매우 위험하다. 따라서 본 연구에서는 수정진동자 미량분석기(QCM)의 표면에 항체를 고정화하여 항원으로써 2,4-dinitrophenol(DNP)를 사용하여 다이옥신의 검출실험에 대한 여러 가지 실험조건을 결정하기 위한 모델링 연구를 행하였다.

이론

체적탄성파 BWA(Bulk Acoustic Wave)를 이용한 AT-cut 수정진동자의 전극표면에서 발생한 질량변화와 공진주파수와의 상관관계는 Sauerbrey에 의해 다음과 같이 유도되었다.[4]

[eqn: DELTA F = -{ {F}^{2} } over { { LEFT ( mu {rho}_{Q} RIGHT ) }^{1/2}} CDOT {DELTA m} over {A}]

여기서 □F는 공진주파수의 변화, F는 공진주파수, □m은 수정진동자 전극표면에서의 질량변화, □는 수정진동자의 변형률, □Q는 수정진동자의 밀도, A는 수정진동자 전극의 면적을 나타낸다.

실험

본 실험의 개략적인 실험방법을 fig. 1에 나타내었다.  QCM의 금 표면위에 단분자막의 형성을 위해 self assembly기법을 사용하여 0.01 M의 cysteamine으로 처리를 하였으며 항체와 결합할 기능기를 형성하기 위해 1 % glutaraldehyde 용액에서 한시간 동안 교반을 하였다. DNP 항체(50 □l/ml)는 항체용액을 aldehyde기가 고정되어있는 QCM의 금표면에 주입함으로서 고정화 시켰다. 미반응 aldehyde기는 0.1 M glycine으로 blocking을 행하였다. 미소량의 항원, 즉 DNP를 검출하기 위하여 DNP와 DNP conjugated albumin의 혼합샘플용액을 사용하여 경쟁반응을 행하였다.

fig.  Procedure of preparation and measurement.

결과 및 토론

Fig. 2는 self assembly의 단계를 거친 후 박막의 형성에 따른 공진주파수의 감소량을 측정하기 위하여 질소로서 박막 형성후의 수정진동자를 건조시켰을 때 시간에 따른 주파수의 변화량을 나타내었다. 본 결과에 따라 박막의 형성후 주파수를 측정하기전의 건조시간은 90분으로 결정되었다. Fig. 3은 항원항체반응에 고정화되는 항체의 농도가 미치는 영향을 조사한 결과이다. 여러 농도의 항체를 각각의 수정진동자에 고정시킨 후 10 □g/ml의 DNP cojugated albumin을 주입하였을 경우의 주파수를 나타내고 있다. 30 □g/ml이상의 항체농도에서 항원항체반응에 따른 주파수가 일정하게 나타나고 있으므로 QCM의 표면에 고정화되는 DNP 항체의 농도는 50 □g/ml로 결정하였다.

Fig. 2. The frequency shift of QCM by dry through N2 flow at self assemble process.

Fig. 3. Frequency shift according to various range of antibody concentration at immunoreaction process.

Fig. 4는 100 ng/ml의 농도로 고정된 DNP conjugated albumin.과 여러 농도의 DNP의 혼합용액을 사용한 경쟁반응에 의한 9 MHz QCM의 주파수 응답을 통해 여러 농도에서의 DNP에 대한 calibration curve를 나타내고 있다. 공백실험은 100 ng/ml DNP conjugated albumin만을 사용하였으며 그 주파수 응답은 약 182 Hz 정도를 나타내었다. DNP 검출에 대한 추세선은 100 ng/ml부터 1 ng/ml의 농도까지는 선형적인 경향을 보여주고 있으나 그 이하의 농도에서는 DNP의 검출이 어려움을 나타내고 있다. 이것은 0.1 ng/ml의 농도에서의 DNP에 대한 주파수응답은 약 166 Hz로써 공백실험의 결과와 거의 구별하기 힘들정도의 낮은 응답을 나타내므로 검출에 어려움이 있다는 것을 보여준다. 따라서 앞으로의 실험에서는 이러한 낮은 주파수응답을 증폭시키기 위해 30 MHz quartz crystal을 사용하거나 항원항체반응이 끝난 후의 수정진동자 위에 DNP 분자와 결합하는 latex 용액을 사용하여 낮은 농도에서의 주파수응답을 증폭시키는 실험을 할 예정이다.

Fig. 4. Frequency shift of competitive reaction for various concentration of 2,4-dinitrophenol by using 9 MHz quartz crystal microbalance.

참고문헌

1. M. Ahel, K.M. Evans, T.W. Fileman and R.F.C. Mantoura, Anal. Chim. Acta,            298(1992) 195.

2. V. Lopez-Avila, P. Hirata, S. Kraska, M. Flanagan, J.H. Taylor, Jr. and S. Hern ,         Anal. Chem., 57(1985) 2797.

3. K.A. Ramsteier, J. Chromatogr., 465(1989) 410.

4. G. Sauerbrey, Z. Phys., 206(1959) 115.