Stirred Cell을 이용한 BSA, BHb-adsorbed microsphere의 정밀 여과 과정 중의 투과 플럭스의 변화

박정민, 최성욱, 방시원, 함승주, 김우식

연세대학교 공과대학 화학공학과

Variation of Permeate Flux during Microfiltration of BSA, BHb-Adsorbed Microspheres in Stirred Cell.

Jung-Min Park, Sung-Wook Choi, Si-Won Pang, Seungjoo Haam

and Woo-Sik Kim

Department of Chemical Engineering, College of Engineering, Yonsei University, Seoul 120-749, Korea

서론

단백질 흡착에 관련된 상호작용력에는 크게 소수성 상호작용력과 정전기적 상호작용력을 흡착 구동력으로 간주한다. 특히 표면전하밀도에 따라 작용하는 구동력의 관계가 변화한다. 즉 소수성 상호작용력에 의해 흡착된 단백질의 양은 표면전하밀도 증가에 따라 감소하고, 정전기적 상호작용력에 의해 흡착된 단백질의 양은 표면전하밀도에 따라 증가한다. 소수성 상호작용력과 정전기적 상호작용력간의 전이점이 존재하며 소수성 상호작용력에 의해 흡착된 단백질의 양은 등전점 부근에서 최대이며 pH에 민감하게 반응한다. 이에 반하여 정전기적 상호작용력에 의해 흡착된 단백질의 양은 pH에 큰 영향을 받지 않는다[1,2].

분리의 구동력으로 소수성 상호작용력과 정전기적 상호작용력을 고려하였다. 이때 소수성 상호작용력은 흡착의 주 구동력으로 작용하며 정전기적 반발력은 흡착을 방해하는 힘으로 작용한다. 본 연구에서 행해진 회분식 분리실험의 결과  높은 표면전하밀도를 지닌 microsphere보다 낮은 표면전하밀도를 지닌 microsphere가 높은 선택도를 나타내었다. 따라서 분리 실험은 낮은 표면전하밀도를 지닌 microsphere를 이용하여 행하였다.

투과 플럭스 실험은 BSA와 BHb각각에 대해서와 BSA와 BHb의 혼합용액에 대하여 각각의 등전점인 pH 4.5와 pH 7에서 시행하였다. 각각의 단백질의 흡착이 microsphere의 안정성에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위한 실험이다. 단백질이 흡착된 microsphere의 안정성을 알아보기 위해서 Zeta Potential Analyser를 이용해 각각의 Zeta Potential 값을 살펴보았다.

분리 실험은 BSA와 BHb의 혼합용액에서 BHb는 흡착시키고 BSA는 용출시키는 과정이다. 낮은 표면전하밀도 영역이므로 소수성 상호작용력이 주 구동력으로 작용하여 흡착시킬 BHb의 등전점인 pH 7에서 최대흡착이 일어나고, BSA는 주어진 pH에서 음전하를 띄게 되어 음이온성 microsphere와 정전기적 반발을 일으켜 그대로 용출하게 된다. 또한 PS/PMAA microsphere의 경우 강산기의 공중합체를 도입함으로써 수소 결합력을 완전히 배제할 수 있다.

실험

1. 실험재료

단백질은 Sigma Chemical Co.의 bovine albumin (BSA, A-7906)과 bovine hemoglobin (BHb, H-2500)을 탈이온 증류수에 용해시켜 사용하였다[3].

Microsphere는 무유화제  유화공중합법을 이용하여 poly(styrene/methacrylic acid) microspher를 제조하였다.

완충용액은 이온강도 0.1의 phosphate buffer를 희석하여 사용하였으며 이온강도는 0.01로 고정하여 사용하였다.

실험에 사용된 모든 물은 Elgastate의 UHQ 초순수 제조장치에 의한 탈이온 증류수를 사용하였다.

2. 실험방법

2.2 투과 플럭스 실험

Acetic buffer와  latex를 0.22□m 정밀여과 막(Millipore Co., Bedford)을 장착한 stirred cell에 넣어 전체 부피는 30mL, 비 표면적은 0.19m2/mL로 만든다. Stirred cell을 교반기 위에 놓고, 약 1m위의 높이에서 완충용액을 흘려주어 투과 플럭스가 정상상태에 이를 때까지 계속한다. 투과 플럭스가 정상상태에 이르면 저장용기에 있는 단백질 용액을 step input시킨다.

시간에 따른 투과 플럭스의 변화를 살펴보기 위해 stirred cell을 통하여 나오는 용액을 1분마다 컴퓨터에 RS 232 C로 연결되어 있는 저울(precision plus, Ohaus Co., USA)로 무게를 측정하여 투과 플럭스를 결정한다.

2.3 연속식 분리 실험

실험하기 전에 반응부피의 10배 이상의 양에 해당하는 buffer를 흘려주어 평형화를 충분히 유지시켰다. 단백질 용액은 저장용기를 이용하여 step input시키고 유출액을 fraction collector로 받아 UV로 분석하였다.

280 nm 와 405 nm에서의 흡광도를 측정하여 간단한 행렬을 사용한 프로그램을 써서 각 성분의 농도를 분석하고 수치적분을 통하여 유출 총량을 산출하였다.

실험결과 및 고찰

BSA의 등전점인 pH 4.5에서의 투과 플럭스 실험에서 BSA용액을 주입시킨 후 투과 플럭스가 증가하는 경향을 보였다. 이는 BSA의 흡착으로 인한 microsphere간의 응집이 발생하여 유효반지름의 크기가 켜졌기 때문이다[4-7].

BHb의 등전점인 pH 7에서의 투과  플럭스 실험에서는 BHb용액을 주입시킨 후 투과 플럭스가 감소하는 경향을 보였다. 이는 BHb가 막 기공의 내부에 흡착되기 때문이다. BSA와 BHb의 투과 플럭스 경향이 이렇게 달리 나오는 이유는 BSA는 적은 양의 흡착으로도 microsphere의 안정성을 잃게 하나 BHb는 많은 양의 흡착으로도 microsphere의 안정성을 잃게 하지 못하기 때문이다.

BHb의 흡착조건인 pH 7의 등전점 하에서 BHb는 표면에 완전히 흡착된 후 유출되며, BSA는 곧바로 유출됨을 볼 수 있다.

혼합성분의 파과 곡선에서 BHb의 파과 곡선은 단일 성분의 파과 곡선과 일치 하지만 BSA는 일치하지 않는다. 이는 BHb가 다른 성분에 영향을 받지 않고 흡착되는 반면에 BSA는 흡착되는 BHb의 방해를 받아 흡착경쟁력이 감소되기 때문이다.

단일 성분 및 혼합 비율을 1:1로 고정하고 전체농도를 변화시키면서 step input시켰을 때의 유속에 대한 전체농도의 영향을 보았다. 농도가 증가할수록 유속은 증가하였으며, 단일성분일 경우가 혼합성분일 경우보다 빨랐다.

참고문헌

[1] 윤정열, 석사학위논문, 연세대학교, 서울, 1993.

[2] J.-Y. Yoon, Park, J.H. Kim and W.S. Kim, J. Colloid Interface Sci. 177, 613 (1996).

[3] R.N.C. Dawson, D.C, Elliot, W.C. Elliott and K.M.Jones, Data for Biochemical Research, 3rd Ed., Owford univ. Press, Oxford, 1986.

[4] Bacchin, P., Aimar, P. and Sanchez, V., J. Membr. Sci., 115, 49(1996).

[5] Hong, S.K., Faibish, R.S. and Elimelech, M.,J. Membr. Sci., 137, 31(1997).

[6] Causserand, C., Jover, L., Aimar, P. and meireles, M., J. Membr. Sci., 137, 31(1997)

[7] Lee, Y.H. and Clark, M.M., J. Membr. Sci., 149, 181(1998).