잿빛곰팡이병의 생물학적 방제를 위한 유효미생물의 선별

김성웅1,3, 김소영1,3, 장인환2, 김홍1, 채희정2

호서대학교 벤처전문대학원1, 호서대학교 식품가공학전공2, (주)AGM바이오텍3

Screening of Microorganisms for the Biological Control of Gray Mold

Sung Woong Kim1,3, So Young Kim1,3, In Hwan Chang2, Hong Kim1

and Hee Jeong Chae2

1Graduate School of Venture, Hoseo University

2Department of Food Science and Technology, Hoseo University

3AGriculture Microbiology Biotech Co. Ltd.,

서론

농업기술의 발달과 함께 재배작물의 규모화, 집단화 및 고품질화를 추구하면서 화학농약의 사용량이 증가하고 살포지역이 광범위해지고 있다. 이에 따라서 환경과 식품의 오염 등 위해성에 대한 우려가 커지고 인체에도 유해한 영향을 끼치고 있다. 화학농약의 반복사용은 저항성 내성균의 출현과 농약 사용량의 증가, 농약의 고독성화를 초래하고 생태적으로 또 다른 내성균의 출현과 이를 위한 처방의 강화 등 끊임없는 악순환으로 이어져 결과적으로 자연생태계에 영향을 줄 수밖에 없는 현실이다. 또한 일반적으로 식물병원균을 방제하기 위해 사용되는 화학농약이나 항생물질계통은 그 사용범위가 상당히 넓은 반면 인체에 유해하고 저항성을 가진 병원균의 출현율을 증가시키고 있는 실정이어서 최근에는 사용숙주 사용범위는 좁지만 이러한 결점을 보완할 수 있는 생물학적 방제에 관한 관심이 고조되고 있다.

이중 식물병원진균인 Botrytis cinerea에 의해 일어나는 잿빛곰팡이병은 과수, 화훼, 채소 등의 원예작물에 손실을 가져와 경제적으로 많은 피해를 주고 있고, 다범성으로 특히 수분이 많은 과육이나, 습기가 많은 서늘한 기온에서 발병이 심할 뿐만 아니라, 실제적인 방제수단으로 사용해 오던 화학살균제에 대한 저항성균이 출현하여 그 방제 대책이 시급한 실정이다. 본 연구에서는 잿빛곰팡이병(gray mold) 방제를 위한 항진균 미생물을 비교탐색하여 농약으로서의 가치가 있는 유효미생물을 선별하는데 목적을 두었다.

실험

1. 사용 균주 및 배지조성

본 실험에 사용된 균주는 잿빛곰팡이병균인 Botrytis cinerea는 한국화학연구소에서, 길항미생물은 문헌상에서 잿빛곰팡이병에 대한 길항력이 보고된 균을 탐색, Serratia marcescens, Enterobactor clocae, Acremonium strictum, Trichoderma harzianum 4속 25균주를 KCTC로부터 분양 받아 사용하였다.

본 실험에 사용된 배지는 병원균 Botrytis cineria와 이외의 Mold류의 계대배양과 대치배양 및 paper disk assay실험에는 PDA (Potato dextrose agar)와 PDB (Potato dextrose broth)를 사용하여 배양하였고, Serratia marcescens등의 Bacteria는 NA ((Nutrient agar), NB (Nutrient broth)를 사용하여, 각각 평판배지와 액체 배지를 사용하여 계대배양 하였다. pH는 5.6로 보정하였다.

2. 계대배양

Botrytis cineria는 병원성을 유지하기 위해 포자를 형성시키며 실험기간 내, PDA 평판 배지를 사용하여 24℃에서 1주 간격으로 계대배양을 실시하였고, 장기보관을 위해서 형성된 포자를 백금이로 회수하여, 2ml conical cap tube에 넣은 후, 멸균수로 희석하였다. 희석된 시료는 원심분리기로 균사와 포자로 분리하였고 glycerin (3%)과 혼합하여 2ml 멸균 tube에 넣어 -70℃에서 동결보관하며 사용하였다.

길항미생물의 계대배양은 실험 목적에 따라, slant 배지와, 평판배지, 액체배지를 사용해 30℃에서 2일간 배양 후 4℃에서 보관하였고, 장기보관을 위해서 각각의 미생물은 glycerin (3%)과 혼합하여 2ml 멸균 tube에 넣어 -70℃에서 동결보관하며 사용하였다.

3. 길항력 검정

병원균에 대한 길항력은 대치배양을 실시하여 측정하였다. 대치배양은 PDA 평판배지의 원점을 중심으로 배지의 양끝단에서 각각 15 mm 떨어진 지점에 각각 3 mm 길이로 백금이로 획선을 하여 병원균과 길항균을 동시에 접종, 배양기(상온)내에서 배양하여, 4일 후에 나타나는 투명환 크기를 관찰하였다.

결과 및 고찰

병원균과의 대치배양 결과 Serratia marcescens KCTC 2356에서 투명환이 5.47 mm (Fig 1.)로 관찰되었고, Trichoderma harzianum (Fig 2.)에서는 Table 1에 나타낸 것과 같이 그중 6개가 Botryitis cineria를 덮어 길항하는 것으로 관찰되었다.

Fig.1 Serratia marcescens

Fig. Trichoderma harzianum

Table 1. Antifungal activity of Trichoderma harzianum on pairing culture test          for molds

Category	Classification	Strain No.	Clear zone
Mold	Trichoderma harzianum	KCTC 6043 KCTC 6385 KCTC 6426 KCTC 6504 KCTC 16923 KCTC 16976 KCTC 16977 KCTC 16979	25.6 mm 36.3 mm 21.9 mm 33.0 mm 26.6 mm 34.5 mm - -

결론

본 연구에서는 정량, 정성적 비교 실험을 위해 in vitro 시험법을 활용하였다. 수십 종의 후보 미생물군으로부터 잿빛곰팡이에 대한 방제력 시험을 통하여 생물농약 개발을 위한 스크리닝 기술, 즉 대치배양 및 paper disk assay를 기반으로한 생물농약의 bioassay 기술을 확립하였으며, in vitro 실험결과, 상온에서의 잿빛곰팡이병에 공시균주 중 Trichoderma harzianum 속의 곰팡이가 길항력이 가장 우수하게 나타나는 것이 입증되었다. 세균 중에는 Serratia marcescens가 약간의 길항력을 보이는 것으로 확인되었다. Trichoderma harzianum은 국내외 연구진들에 의해 여러 식물병원균에 대한 방제 실험이 진행되고 있고, 미생물 농약으로도 개발 중에 있는 균주이다.

본 연구에서는 토양으로부터의 미지의 미생물 스크리닝 작업을 일부 수행하였으나 주로 공시균주를 시험대상으로 한 항균력 시험을 위주로 수행되었다. 이 항균력 시험 결과를 토대로 상업성 있는 균주의 확보를 위한 균주 개량 프로그램의 도입이 필요하다고 판단되며 병해가 적은 토양 등의 자연으로부터의 광범위한 균주스크리닝의 기반을 제공하였다.

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