환경 유해성 평가를 위한 재조합 동물세포 개발 및 반응 특이성 확인

김은진, 구만복

광주과학기술원 환경공학과

Recombinant Mammalian Cell Development and Characterization for           Evaluation of Environmental Toxicity

Eun-Jin Kim, Man-Bock Gu

Kwangju Institute of Science and Technology, Dept. of Environmental         Engineering

서론

현대 사회에 문명의 발달은 인간에게 많은 이익과 함께 또다른 문제점을 야기시켰다. 이것이 바로 인체에 유해한 환경오염이다. 환경오염을 방지하기 위해 환경을 청정하는 기술도 중요하지만 이런 독성물질을 빠르게 탐지하는 오염도 모니터링방법은 이 분야에 새로운 접근 방법이며 그 적용분야도 다양하다. 특히 생물체를 이용한 바이오 모니터링 시스템은 그 적용 목적이 역시 생물체인 인간임을 생각할 때 더욱 중요하다.

현재까지 연구되어온 바이오 센서를 살펴보면 미생물이 주된 도구로 사용되어왔다. 이 방법은 여러면에서 편리하기도 하지만 바이오 모니터링의 근본 목적인 인간에 대한 유해성 평가를 하는 기준 설정면에서 볼 때 미생물과 인간 사이의 연관관계가 매우 먼 만큼 그 적용에도 모순이 있다. 그런 의미에서 인간에 좀더 가까운 포유동물 세포를 이용함으로써 환경 유해성에 대한 민감도를 더욱 높여 인간에게 좀더 적용 가능한 자료들을 제시할 수 있다.

본 실험에서는 동물세포의 대표적인 스트레스 반응인 Apoptosis(세포 자동 사멸) 현상을 이용했다.  생명체들은 각자 수많은 환경 스트레스 속에서 생존할 수 있는 적응 방법을 터득했는데 이것이 스트레스 반응이다.

이 환경 스트레스 중 가장 대표적인 것이 DNA손상이다. 손상을 입은 세포는 비정상적 신호전달체계를 갖는데 이것은 포유류에 있어 매우 위험한 영향을 끼칠 수 있다. 이런 현상을 방어하는 것이 포유류에서는 Apoptosis이다. 위험성을 가진 세포는 스스로 자동사멸 시킴으로 인해 주변 세포들의 큰 위험성에 노출되는 것을 예방하는 기작이다.

그러므로 이 현상에 대한 규명은 매우 중요하다.

Apoptosis에 관여하는 유전자중 c-fos라고 알려진 유전자가 있는데 이것의 발현 방식은 Apoptosis과정에 있어 중대한 영향을 나타낸다.

본 실험은 이런 개념을 이용해 c-fos promoter를 reporter 유전자(fluorescence)와 융합시켜 DNA 스트레스 하에 독성이 세포에 어떤 영향을 일으키는지 모니터링해 그 독성물질의 생물학적 유해성을 탐지할 수 있는 방법을 연구했다.

실험결과 및 방법

본 실험에서는 인간의 유전자인 c-fos유전자를 형광 유전자(fluorescent gene)와 융합시킨 재조합 DNA를 제조했으며 그 과정에서 c-fos증폭을 위해 PCR을 이용했으며 형광 유전자는 pEGFP-N1을 사용했다. 이렇게 만들어진 재조합 유전자(pKCFG)는 JM109라는 E.coli에 형질전환시켜 증폭 시켰다.

증폭된 유전자가 작동되기 위한 숙주로는 CHO(Chinese Hamster Ovary)cell을 사용했으며 CaPO4 방법을 이용해 유전자 형질전환된 동물세포를 얻었다. 그후 FACS 분석을 통해 형질전환 여부를 관찰했다.

형질전환된 세포는 부착배양과 부유배양을 통해 독성물질 테스트를 위한 환경으로 적응시켰으며 이를 이용해 DNA 손상물질의 대표적 물질인 MMC(Mitomycin C)를 이용해 그 독성을 탐지했다.

결과 및 고찰

c-fos와 pEGFP의 GFP(Green Fluorescent Protein)을 이용해 재조합된 유전자를 만들었으며 이 유전자를 여러 제한효소로 처리해 만들어진 유전자의 정확성 여부를 확인했다. 그림 1의 (a)는 재조합된 유전자의 지도를 나타내며 (b)는 그 유전자의 정확성 확인위한 제한효소 처리후의 전기영동 사진을 나타낸다.

그림 2는 FACS 분석 결과이다. (a)는 유전자가 삽입되지 않은 CHO cell이고 (b)는 재조합된 유전자가 삽입되어 빛을 내고 있는 CHO 세포이다.

여기서도 보듯이 우측 사진에서 강렬한 intensity를 가진 cell과 아닌 cell로 뚜렷한 구분이 되는 것을 관찰 할 수 있다.

다음으로는 부착배양 세포에 직접 MMC를 주입해 독성실험을 하여 그 독성 물질의 유해성을 탐지했다.(그림 3)

그림 1(a) pKCFG 지도

Ladder           1    2    3

그림 1(b) 제한효소 처리후 전기영동 사진

그림 2(a) FACS 분석 with wild type CHO Cell

그림 2(b) FACS 분석 with pKCFG

그림 3 여러 농도의 MMC에 따른 부착 배양 재조합 동물세포의 viability

참고문헌

1) Aliaon J. Mastrangelo , Michael J. Betenbaugh.

Overcoming apoptosis: new methods for improving protein-expression      systems.  TIBITECH. 16,88-95. 1998

2) Gu M.B., Dhurjati P.S., Van Dyk T.K. and LaRossa R.A.

A miniature    Bioreactor for Sensing toxicity

Using Recombinant Bioluminescent Escherichia coilcells

Biotechnol. Prog. 12,393-397. 1997

3) Min J.H., Kim E.J., LaRossa R.A., Gu   M.B.

Distinct responses of a recA::luxCDABE Escherichia coli strain to direct

and indirect DNA damaging agents.

Mutation Research 422,61-68.1999

4) Gloria A. Preston... Induction of Apoptosis by c-fos protein.

Molecular and cellular Biology 16,1,211-218. 1996

5) Jae-Hong Kim.. Essential role of Rac GTPase in

hydrogen peroxide-induced activation of c-fos serum response element.

FEBS Letters 406,93-96. 1997