재조합 생물의약품의 생산을 위한 동물세포 배양 공정

조 의 철

경기도 용인시 구성면 보정리 341 목암생명공학연구소 신기능 연구센터

Mammalian cell culture process for production of biopharmaceuticals

Eui-Cheol Jo

MOGAM Biotechnology Research Institute, Biologics Center

341 Pojung-Ri Koosung-Myon Yongin, Kyonggi-Do 449-910

서론

1987년 t-PA가 FDA의 발매승인을 받아 시판되기 시작한 이래 동물세포를 숙주세포로 하는 재조합 단백질의 생산방법은 E.coli, Yeast가 주요한 발현숙주계로 널리 사용되는 환경 속에서도 미생물 숙주계의 단점을 보완할 수 있으리라는 기대 속에서 꾸준히 사용되어 왔다.

1980년대에 Genentech 등에서 개발을 추진 중이던 t-PA는 많은 미생물 숙주계를 이용하여 개발 중이던 다른 생물공학 회사들과의 치열한 경쟁 속에서 최종적으로 상품화에 성공하였다. 시약용 단일세포군 항체 생산 이외에 동물세포 숙주계를 이용한 재조합단백질 의약품이 전무하던 당시에 발현정도와 숙주세포의 생장속도에서 많은 단점을 가지고 있을 뿐 만 아니라, 생산 경험도 전혀 없는 동물세포 숙주계를 이용한 제품을 상품화하는 데 대해서 대부분의 사람들은 많은 회의를 품고 있었으며, 9번의 기적이 일어나야만 가능한 일이라고 공공연히 주장되곤 하였다 (1). 그러한 경쟁은 각종 공정 경제적 분석과 기원을 달리하는 동일물질의 치료효율에 대한 끊임없는 연구를 촉발시켰으며, t-PA의 제품화 성공은 동물세포 숙주계를 사용하는 의약품 산업화의 전기를 마련한 것이었다 (2).

그 이후, 동물세포 숙주계를 이용하여 생산되는 많은 재조합 치료의약품들이 상품화에 성공하여 전세계 의약품 시장에 있어서 중요한 위치를 차지하고 있으며, 특히 최근의 각종 인간 단일세포군 항체의 잇따른 상품화는 동물세포 배양공학 연구의 새로운 계기가 되고 있다.

이러한 가운데에 지난 10여 년 간 국내에서는 동물세포 숙주계를 이용하는 치료 의약품은 매우 더딘 속도로 개발되어 왔던 것이 사실이었으며, 최근 Erythropoietin의 경우를 제외하고는 아직도 뚜렷한 변화는 감지되고 있지 않다. 본 논문에서는 동물세포 숙주계를 이용하는 재조합 치료 의약품 개발의 현황, 문제점, 향후 전망 등을 살펴보고, 일례로 재조합 prourokinase을 model로 하는 생산공정 연구 결과를 발표하고자 한다.

본론

동물세포배양을 이용한 치료의약품 현황

현재까지 12가지의 viral vaccine, 16가지의 재조합 의약품이 의약 당국의 허가를 얻어 시판되고 있고, EPO, Factor VIII등은 상당한 시장 규모를 차지하고 있다. 1986년 OKT-3가 인가를 받은 이래 7가지의 인간 또는 인간화 단일세포군 항체 제품들이  상품화되었으며, 다수의 제품들이 승인을 기다리고 있다 (1).

현재 제품화된 재조합 의약품의 절반 정도가 동물세포 숙주계를 이용하는 것이며, 임상시험중인 의약품 후보 물질의 절반 이상이 또한 동물세포 숙주계를 이용하는 것으로 알려져 있다. 1996년의 통계를 보면, 동물세포 숙주계를 이용하는 재조합 치료 의약품과 인간 단일세포군 항체의 전세계 시장 규모는 35억불에 달하고 여기에 전통적인 viral vaccine류가 10억불 정도의 시장 규모를 점유하고 있다. 이것은 2,750억불 정도인 전세계 의약품 시장의 2%에 해당하는 것이다. 그러나, 35억불중 22억불이 Erythropoietin에 의한 것으로서 이제 막 상품화에 진입한 후속 상품들의 적응증, 시장확대 등의 여부에 의해서 제품간의 시장 균형은 이루어지리라 예견된다.

생산기술 현황

동물세포 숙주계를 이용하는 의약품의 인가에 있어서 끊임없는 문제로 제기된 것은 혈청을 배지에 첨가하여 사용하는 점이었다. 각종 virus와 mycoplasma의 오염 여부가 까다로운 규제 하에 통제되고 있고, 이러한 상황은 새로운 바이러스 또는 미생물의 출현 또는 대량 감염으로 더욱 더 엄격해지고 있다. 따라서 무혈청 배지, 나아가서는 무단백 배지의 필요성이 한층 더 부각되었으며, 게다가 동물유래의 조성물을 사용하는 것은 사실상 금지되고 있다. 하지만 이러한 상황은 지난 10수년간의 연구 결과로 정착된 무혈청, 무단백 배지 제조 및 그 이용 기술의 확립으로 동물세포배양 방식에 의한 의약품 생산에 적절한 해결책을 제공하게 되었다.

배양 용기로 전통적인 virus vaccine의 생산에 널리 사용되어 왔던 t-flask, roller bottle을 탈피하여 미생물 발효에 경우와 같이 STR을 기본으로 하는 bioreactor를 이용하는 방식이 정착되었다. 현실적으로 배양 용기와 배양 방식을 결정하는 데 있어서 고려해야 할 사항은 단순한 생산성 측면 이외에도 많은 인자들이 있다.     그러한 인자들에는 먼저 제품의 비활성과 그에 따른 dosage, 발현량 및 비생산성 등이 종합적인 공정 분석과 시장 예측 등에 의해 결정될 수 있는 데, 여기에 다른 생산 방식을 택할 경우, 인가에 필요한 시간과 인력 재교육, 설비 투자 등을 비교 분석하여 결정되어야 할 것이다. 마지막으로 이미 어떠한 시설과 그 운영 경험을 보유한 경우 웬만큼 이득이 없는 한 기존의 시설과 동일한 방식을 채택하게 될 것이다. 이러한 현실적 판단이 그 동안 많은 연구가 진행되어 그 우수한 생산성이 입증된 perfusion culture와 같은 연속 배양 방식의 생산 기술 도입을 오랫동안 차단하는 결과를 초래하였으나, Factor VIII, IX의 경우에서와 같이 이제 서서히 생산 현장에 도입되고 있다 (3).

국내 연구 사례

pro-Urokinase (pro-UK; scu-PA)는 각종 동, 정맥 혈전, 심근경색 등의 치료제로 널리 사용되어 왔던 urokinase의 전구 물질로서(4), 기존의 urokinase가 보유하지 못한 혈전 친화특이성을 보유하는 등 부작용을 개선할 수 있는 것으로 기대되며 특히 최근의 전임상과 임상 시험 결과 허혈성 뇌졸중에 대해서는 t-PA보다 우수한 것으로 알려진 혈전 용해제이다(5,6,7,8). 본 연구소에서는 1) 동물세포에서의 재조합 pro-UK의 발현, 2)재조합 세포주의 serum-free media배지 개발 및 적응, 3) 배양 방식에 따른 생산공정 비교 4) 정제 공정 개발 5)물리화학적 성질 확인 6)in vitro 및 invivo efficacy등의 연구를 통한 일련의 생산 공정을 확립하였다.

Human kidney cell line유래의 pro-UK cDNA를 CHO DG-44 세포주에 co-transfection시켜 pro-UK를 발현하는 재조합 CHO 세포주를 제작, 고생산주, MGpUK clone을 선별하고, 본 연구소 고유의 무혈청 배지 (KGCC-CHO-P1과 epti*)를 사용하여 Spinferm bioreactor에서 perfusion culture를 수행하였다. 배양은 2 x 105 cells/ ml 의 접종농도로 시작하여 세포의 농도가 계속 증가하여 약 9-50 x 106 cells/ ml 의 고농도 배양이 안정하게 유지되었으며, 30~45일 동안의 평균 생산량은 약 30-50 mg/l 정도였다. 총 800 L의 배양액을 일련의 ion exchange column chromatography와 affinity chromatography를 거쳐 순도 99%이상의 pro-UK가 순수 정제되었으며, 분리된 pro-urokinase는 depyrogenation 과정을 거쳐, 효능 및 안정성시험 등에 사용되었다.

In vitro lysis model에서 Human plasma내의 125I-labelled pro-urokinase의  fibrinolysis는 D-dimer로, fibrinogenolysis는 fibrinogen degradation product로 측정하였는 데, Pro-UK의 혈전용해능은 dose-dependent하게 나타났다. Rabbit Jugular Vein Thrombus Model을 이용한 in vivo efficacy test에서 (9), 투여량 80,000 IU/kg의 pro-UK를 bolus/bolus injection하였을 때에도 우수한 혈전 용해 활성을 관찰할 수 있었다.

결론 및 향후 전망

기 확립된 재조합 치료 의약품의 상품화는 prompter, enhancer, amplfication system의 개선과 cell-cycle의 control, post-translational process의 연구 진보에 따른 대사공학적 접근에 따른 생산성 향상과 단백질의 균일한 발현 조절, 활성 향상에 의해 더욱 더 가속화 될 것이다. 특히, 동물세포 배양 기술이 주요 요소 기술로서 의약품 개발이 유망한 새로운 분야로서 다음과 같은 분야가 있다.

인간 단일세포군 항체분야는 오랫동안의 숙제로 남아 있던 면역 거부 반응 (HAMA)과 생체 내에서의 짧은 반감기를 개선할 수 있는 DNA 및 protein engineering 기술의 진보로 이미 그 가속화된 개발 속도가 앞으로도 계속 될 것으로 예측된다. 조직공학분야에서는 세포배양방식에 의한 인공 피부가 상품화된 것을 필두로 다양한 인공조직의 개발이 전망된다. 이외에도 각종 연골 조직, 인공 근육 등 인공조직의 개발을 목표로 국내외적으로 다수의 거대 기업과 특히 벤처기업들이 상품화를 시도하고 있다. 최근의 폭발적인 발전을 보이고 있는 유전자 치료법은 아직도 vector개발, packaging cell line 개발, 지속적인 유전자 발현과 특히 안정성에 관한 많은 연구를 필요로 하고 있지만, 가장 연구 진행이 빠른 경우 2-3년 내에 임상시험이 완료되리라 전망된다. 유전자 치료제의 전임상, 임상 시험 및 제품 생산에 필요한 유전자 전달체 대량생산 공정 개발과 실제 생산에도 기존의 동물세포배양 기술이 응용될 전망이다. 더욱 더 폭발적인 파급 효과를 가져오리라 기대되는 Stem cell culture분야는 stem cell의 특이 유전자를 조작하여 특정 질환을 치료한다는 개념으로 폭 넓은 응용 가능성을 내포하고 있다. 성공 여부는 핵심적으로 세포의 life-span을 어떻게 인위적으로 결정할 수 있을 것인가 하는 것과 세포의 분화를 어떻게 조절할 수 있을 것인가 하는 것으로서 이러한 문제의 해결과 함께 완료단계에 다다른 Human genome project에 의해 서열이 밝혀진 각종 유전자의 기능이 하나둘씩 밝혀지면 stem cell culture에 의한 질병 치료의 실현 가능성은 점차 높아질 것이다.

이상과 같은 각 분야의 연구가 진행됨에 따라 앞으로 동물세포 이용 기술은 더욱 더 분화되고 발전하리라고 예측되며 전체 의약품 시장에서 차지하는 비중도 한층 높아지리라고 생각된다.

참고문헌

1. Lubiniecki, A. S. (1998) Historical reflections on cell culture engineering. Cytotechnology 28: 139-145.

2. Datar, R. V., Cartwright, T. and Rossen, C. -G. (1993) Process economics of animal cell and bacterial fermentations: A case study analysis of tissue plasminogen activator. Bio/Technol. 11: 349-357.

3. Kadouri, A. and Spier, R. E. (1997) Some myths and messages concerning the batch and continuous culture of animal cells. Cytotehnology 24: 89-98.

4. Kasai, S., Arimura, H., Nishida, M. and Suyama, T. (1985) proteolytic cleavage of single-chain pro-urokinase induces conformational change which follows activation of the zymogen and reduction of its high affinity for fibrin. J. Biol. Chem. 260(22) 12377-12381.

5, Credo, R. B., Burke, S. E., Barker, W. M., Villard, E. M., Sweeny, J. M., Henkin, J., and Sasahara, A. A. (1997) Recombinant glycosylated pro-urokinase: Biochemistry, pharmacology, and early clinical experience. In: A.A. Sasahara and J. loscalzo (Eds.) New therapeutic agents in thrombosis and thrombolysis pp.561-589. Marcel Dekker, New York.

6. Burke, S. E., Lubbers, N. L., Nelson, R. A. and Henkin, J. (1997) Comparison of dose regimens for the administration of recombinant pro-urokinase in a canine thrombosis model. Thromb. Haemostas. 77(5): 1025-1030.

7. del Zoppo, G. J., Higashida, R. T., Furlan, A. J., Pessin, M. S., Rowley, H. A., Gent, M., and the PROACT Investigators (1998) PROACT: A Phase II randomized trial of recombinant pro-urokinase by direct arterial delivery in acute middle cerebral artery stroke. Stroke 29:4-11.

8. Furlan, A., Higashida, R., Wechsler, L., Gent, M., Kase, C., Pessin, M., Ahuja, A., Callahan, F., Clark, W. M., Silver, F., Rivera, F. and the PROACT Investigators (1999) Intra-arterial prourokinase for acute ischemic stroke: The PROACT II study; a randomized controlled trial. JAMA 282(21): 2003-2011.

9. Collen, D., Stassen, J. M. and Verstraete, M. (1983) Thrombolysis with human extrinsic (tissue-type) plasminogen activator in rabbits with experimental jugular vein thrombosis. J. Clin. Invest. 71: 368-376.