식물세포배양에 의한 생리활성물질 고 수율 생산

변 상 요

아주대학교 공과대학 화학·생물공학부

Plant cell culture process for high yield production of bioactive products

SangYo Byun

School of Chemical Engineering and Biotechnology, Ajou University

Suwon, Kyonggi-Do 442-749

서론

식물세포배양을 통한 생리활성물질의 생산은 여러 장점으로 학문적 또는 산업적인 관심 분야이다. 하지만 현재까지 산업화 실적은 다양하지 못한데 이는 여러 원인으로 직접적인 식물재배 및 추출에 의한 생산보다 생산성이 떨어지기 때문이다. 따라서 식물세포배양을 통한 생리활성물질 생산의 생산성을 증가시킬 수 있는 다양한 방법들에 대한 연구개발이 계속되고 있으며, 일부 훌륭한 결과를 보이며 산업화로 이어지고 있다. 또한 식물세포 배양에서 생물반응기의 적용은 주로 성공적인 실험실 규모의 우수한 연구 결과가 있은 다음으로 볼 수 있는데, 이때 반응기를 적용하게되면 실험실 규모의 flask 배양과 매우 다른 배양 환경이 제공되어 이로 인한 세포의 생장과 유용물질의 생산성에 변화가 생기기 마련이다. 일반적으로 생장이 느려지고 생산성이 감소하며 생성물의 조성에도 변화를 보이는 경우가 대부분이다. 이러한 반응기 적용에 의한 생산성 감소는 식물세포 배양의 상업화 과정에서 하나의 큰 문제점으로 제기되고 있으며 이의 해결을 위한 많은 연구가 필요한 실정이다. 이러한 세포 배양에 대한 기본 연구를 바탕으로 생리활성물질 대량생산을 위한 생물반응기 적용 연구를 통하여 생산성을 회복시킴으로서 생리활성물질의 경제적인 대량생산의 길이 열릴 것으로 생각된다.

본론

식물세포배양에서 생산성 증가 방법

Elicitation : 식물세포 배양에 elicitor의 적용은 이차대사산물의 생산성을 증가시키는 가장 효율적인 방법중의 하나로 알려져 있다(1). 다양한 종류의 elicitor를 적용하여 생리활성물질 생산에 미치는 영향을 연구하여 최적 elicitor를 선발할 수 있다. 선발된 elicitor를 효과적으로 이용함으로서 생산성 향상에 큰 기여를 할 수 있다. 1차적으로 배양에 투여하는 최적 elicitor의 농도를 알아야 한다. 과도한 elicitor 농도는 새포 생장에 부정적인 효과를 보이기도 한다. 세포의 성장 단계 중에서 elicitor를 투여하는 최적 시기를 밝혀냄으로서 생산성 향상에 효과를 볼 수 있다. 또한 elicitor를 적용할 때 배지 성분들의 최적 농도가 보통 배양 때와 다르기 때문에 elicitor의 적용 시 이들의 최적화가 다시 필요하다. 이러한 현상은 배양 조건에도 적용되므로 elicitor 적용 시 최적 배양 조건, 특히 빛, pH 등을 밝힌다. Elicitor를 적용하여 가장 큰 생산성 향상 효과를 볼 수 있는 것이 전구체의 동시 투여이다. Elicitor의 적용에 의하여 생합성 과정의 많은 효소들이 유도(induce)되면서 양적으로 증가하여 전구체의 소비 속도가 빨라지고 생리활성물질의 생산이 매우 증가하기 마련이다.

Two-phase Culture 연구 : Two-phase 배양법은 mass transfer 개념을 이용하여 세포에서 생산되는 이차대사산물을 외부에서 제공하는 흡수물질로 지속적으로 흡수시켜, 세포 내 이차대사산물의 농도를 낮춰 feed-back inhibition을 제거함으로서 이차대사산물을 지속적으로 생산할 수 있게 하는 방법이다(2). 생리활성물질을 효율적으로 흡수하는 흡수물질(accumulation phase)을 선발하여 이들의 생산성을 증가시킬 수 있다. 대표적인 accumulation phase로서, XAD-2, Xad-4, XAD-7 과 같은 solid phase와, Miglyol 812, oil 계통 등의 liquid phase 등이 있다.

Two-step Culture 및 Production Medium 개발 : 생리활성물질들은 주로 이차대사산물로서 세포에서 이들의 생성 패턴은 세포의 성장이 충분히 이루어진 뒤에 생성되기 시작하는 non-growth associated 형태를 보일 것이 많다. 따라서 세포성장과 생리활성물질 생산을 분리시켜 각각의 최적 조건을 유지시키는 two-step culture 방법을 적용하는 것이 세포 성장 및 유용물질 생산에 유리하다. 특히 two-step culture중 생산 단계에 필요한 production medium(생산배지) 개발이 필수적이다.

생물반응기 적용 및 대량 생산 연구

Bioreactor Type : 식물세포배양용 생물반응기는 크게 세포배양 반응기와 기관배양 반응기로 나눌 수 있다. 세포배양 반응기는 다시 현탁세포배양 반응기와 고정화세포 반응기로 구분된다. 이들 반응기의 차이점 또는 이들 반응기 선택에 있어서 중요한 요인으로서 세포와 세포 그리고 영양성분의 상호 관계를 들 수 있다. 현탁세포배양 반응기는 공정이 간단하고 운전이 쉬운 장점등이 있으나 가장 큰 장점으로서 세포성장을 들 수 있다. 왕성한 세포성장을 유도하여 높은 세포밀도를 유지할 수 있가 때문에 전체적으로 단위 부피당 세포질량과 유용물질 생산성 등을 다른 반응기 보다 높게 유지할 수 있게 된다. 반면에 세포밀도가 높게 유지되기 때문에 공급기체나 영양성분등의 물리적인 분산(dispersion)이 항상 문제가 된다. 일반적으로 식물세포의 산소 요구량은 박테리아에 비하여 약 10% 수준이지만 실제 식물세포는 높은 임계산소농도(critical oxygen level)를 요구하고 있어 적정 수준의 aeration 과 mixing을 해야한다. 또한 대부분의 식물세포는 shear에 민감하기에 적절한 aeration 과 mixing 방법등이 고려 되어야 한다. 이러한 aeration 과 mixing 방법을 고려하여 경험적으로 어느정도 낮은 세포밀도(<약 20g/L) 배양에는 airlift 형식의 반응기를, 이보다 높은 세포밀도 배양에선 stirred tank 형식의 반응기를 사용하고 있으며 이때엔 특수 고안된 marine, sail 및 helical 형식의 impeller등을 사용한다(3).

Bioreactor Microenvironment

㉠ Mixing : Mixing 의 정도를 나타내는 척도로서 Bodenstein number(Bo) 나 Peclet number 또는 mixing time 등을 이용한다. Airlift fermentor에서는 주로 Bodenstein number 를 이용하는데 이는 길이방향(longitudinal)의 교반의 정도를 말한다. Stirred tank reactor 의 경우 주로 mixing time 을 이용하여 mixing 의 정도를 측정할 수 있다. Mixing time(tm) 은 다음과 같은 실험식으로 구할 수 있다. tm = 6(Tv/D)3/N Np0.33 여기서 N 은 각속도, Tv 는 vessel diameter, D 는 impeller diameter, Np 는 impeller power number 를 나타낸다. 그러나 이 식은 Reynold number 가 10,000 이상에서 주로 적용되기 때문에 식물세포배양용 생물반응기에서는 이 식을 그대로 적용할 수 없다. 따라서 낮은 Reynold number 값을 가지는 생물반응기에 적용 가능한 실험식을 도출하든지 상기 실험식을 낮은 Reynold number 에서도 적용시킬 수 있도록 보정하여야 한다.

㉡ Oxygen transfer : 생물반응기의 효율을 결정하는 가장 중요한 변수인 산소전달 속도는 Qo2 = kLa(c*-c) 로 표시된다. 여기서 Qo2 는 단위부피당 산소전달 속도이며, c* 와 c 는 각각 gas phase 와 평형상태에 있는 액체 및 배지의 산소농도를 나타낸다. kLa는 specific volumetric oxygen transfer coefficient 를 나타낸다. 결국 kLa 값이 oxygen transfer 정도를 결정하며 이값은 실험식을 이용하여 구하거나 다양한 형태의 fermentor 에 대한 specific power input 과 연관되어 실험자료 그래픽을 통하여 구할 수 있다.

㉢ Shear  : 생물반응기 중에서 shear 가 문제시 되는 것은 주로 stirred tank reactor 이다. impeller 의 회전과 회전시 발생하는 배지 면 사이에서 발생하는 shear 는 배양중인 식물세포를 충분히 파괴할 정도로 식물세포배양 생물반응기에서는 중요한 factor 가 되어왔다. 실제 배양중인 세포를 Midler 와 Finn 이 고안한 laminar shear device와 같은 shear 측정장치에 넣고 측정하는 것은 불가능하다. 대신 shear 정도를 나타내는 다양한 종류의 shear factor 를 이용한다. Stirred tank reactor 에 주로 적용되는 shear factor 로서 integrated shear factor(ISF), average shear factor 및 Kolmogorov eddy length scale 등이 있다. 그중 ISF 나 average shear factor 는 scale-up 에 적용하는데 한계가 있기때문에 본 연구에서는 주로 식물세포 현탁배양에 적합한 Kolmogorov eddy length scale(□) 을 이용한다(4).	□  = (vl3/□e)0.25, □e =  NpN3D5/ V  여기서 vl 은 liquid velocity, V 는 liquid phase volume 을 나타낸다. 이들 shear factor 들과 배양중인 식물세포의 생존율 및 유용물질 생산성과 서로 correlation 하여 stirred tank reactor 에서 shear 의 영향을 밝힐 수 있다.

㉣ 생물 반응기에서 gas phase 영향 : 생물 반응기에서 식물세포를 현탁배양할 때 oxygen transfer 못지 않게 gas phase의 CO2 나 휘발성 물질등의 유지가 중요하다. 산소 전달을 위한 aeration 은 CO2 나 휘발성 물질등을 stripping 시켜 결국 반응기 내의  세포의 생장과 생합성을 의한 또 다른 micro- environment 의 변화를 초래하면 생산성의 변화가 생기기 마련이다. 실제 flask 배양시 flask 내부의 gas phase 에서 CO2 농도는 10 % 이상까지 올라가지만 계속적으로 aeration 하는 생물반응기에서 gas phase의 CO2 농도는 1 % 이하이다. CO2 는 식물세포 배양에서 중요한 역할을 하는 기체로서 이의 조성 변화는 세포 생장과 유용물질의 생산성 감소로 이어지고 있다. CO2 외에 많은 휘발성 물질들도 생물반응기에서 aeration 에 의하여 손실을 입게 되어 생산성 감소의 원인이 된다. 또한 CO2 외에도 휘발성 물질 중에서 중요한 역할을 하는 ethylene 을 대상으로 이들의 유실과 세포의 생장 및 유용물질 생산성 감소와의 관계를 밝히고, 이들을 생물반응기에 보충하였을 때 세포 생산 및 생산성 회복간의 관계를 밝힐 필요가 있다.

대량 생산과 Scale-up : 대량 생산을 위하여 scale up을 하게되면 상기 배양환경 factor들 즉,mixing, oxygen, shear등을 모두 소형 생물반응기 때와 동일하게 유지할 수 없게 된다. 따라서 생산성 감소현상이 발생하고 이의 회복을 위한 운전조건에 대한 연구를 한다. 또한 scale-up에 의한 aeration증가로 휘발성 유용물질의 stripping이 증가하게 된다. 특히 CO2와 ethylene의 유실에 의한 생산성 감소 영향을 파악하여 large scale의 생물반응기에 이들 성분을 보충할 때 세포성장 및 생산성 회복에 주력하여야 한다.

참고문헌

1. Byun, S. Y., Y. W. Ryu, C. Kim, and H. Pedersen (1992) J. Ferment.

Bioeng. 73: 380-385.

2. Byun, S. Y. and H. Pedersen (1994) Biotechnol. Bioeng. 44: 14-20.

3. Treat, W. J., C. R. Engler, and E. J. Soltes (1989) Biotechnol. Bioeng.,

34:1191-1202.

4. van't Riet, K., and J. Tramper (1991) Basic Bioreactor Design, Marcel

Dekker, Inc., NY,