광학분할 크로마토그래피 조업변수가 라세미 키랄의약품

분리도에 미치는 영향

송태호, 서성섭, 최민호, 이중기*, 박달근*

한국과학기술연구원 청정기술센터*,

홍익대학교 화학공학과

Effects of operating parameters of chiral chromatography on the resolution of racemic chiral drug

TaeHo Song, Sung-Sup Suh, Min-Ho Choi, Joong Kee Lee*, DalKeun Park*

Clean Technology Research Center,  KIST*,

Department of Chemical Engineering, Hongik University

서론

고성능 액체 크로마토그래피로부터 분리가 일어나는 과정은 흡착질과 이동상 사이의 강한 상호작용에 의한 체류시간의 차이로 결정된다[1]. 특히 라세미 혼합물이 키랄 고정상 크로마토그래피에서 분리되는 것은 한 쌍의 광학 이성질체들이 키랄 고정상과 상호작용을 하면서 일시적인 부분 입체 이성질 착물의 안정성 차이에 의해 광학분할이 이루어지는 것이다[2].

광학분할을 위하여 선행되어지는 과정은 라세미 혼합물의 분자식에 근거하여 분리를 가능하게 할 것으로 예측되는 고정상의 선택이다[3]. 분리가 뚜렷이 얻어질 수 있는 고정상 물질을 찾은 뒤 분리공정을 발전시키기 위한 과정으로서 체류시간에 영향을 주는 조업조건의 변화를 통하여 향상된 분리도를 얻을 수 있다. 체류시간은 키랄 고정상 칼럼내의 물질수지식으로부터 알 수 있듯이 흡착평형, 고정상과 상호작용이 없는 물질의 체류시간(dead time), 칼럼내 고정상과 이동상의 부피비(상비) 그리고 칼럼 충전밀도로부터 결정된다. 다른 조업조건을 일정하게 하였을 때 흡착평형에 영향을 주는 조건으로 주입농도를 증가시키는 방법과 주입농도는 이동상내의 흡착질의 농도보다 높게 유지하고 이동상 내에 흡착질의 농도를 증가시키는 방법이 있다. Dead time에 영향을 주는 조건으로는 이동상 조성변화와 이동상 유속변화이다. 칼럼 충전밀도와 상비는 칼럼팩킹방법과 흡착제의 크기가 영향을 준다.

본 연구에서는 체류시간에 영향을 주는 요인 중에서 칼럼 충전밀도와 상비는 고정하였고 흡착평형과 상비에 영향을 주는 조업조건과 체류시간사이에 상관관계식을 얻었다. Pulse method를 통해서 competitive bi-langmuir isotherm을 구하였고, 주입농도의 증가에 따라 체류시간과 상관관계식을 비선형 최소자승법을 통하여 얻었다. Dead time에 영향을 주는 조업조건으로써 이동상 조성, 이동상 유속과 체류시간사이의 상관관계식을 얻었다. 여기서 얻은 상관관계식들을 이용하여 시간에 따른 조업조건의 변화로부터 체류시간의 변화를 알 수 있었고, 이 결과를 이용하여 시간에 따른 조업조건의 변화가 체류시간에 영향을 주므로 분리도의 변화를 예측할 수 있었다.

실험

본 실험에서 사용한 실험장치는 고압펌프 (Young-Lin M930) 2개, injection system (syringe+sample loop), gradient mixer (Waters), UV spectrometer (Young-Lin M720), data aquisition (Young-Lin, Autochrowin)을 사용하였다. 실험은 isocratic mode와 gradient mode에서 시간에 따라 이동상내의 시료의 농도, 이동상 조성비, 이동상 유속을 변화시켜 실험하였다.

실험에 사용된 흡착제는 지름 10□의 Kromasil□(Eka Chemicals)을 사용하였는데 이 물질은 실리카젤에 O,O'-bis(4-tert-butylbenzoyl) -N,N'- diallyl- L - tartar diamide이 공유결합된 물질로 측정된 particle density는 약 0.77g/□이다. 실험에 사용한 시료 라세미 이브프로펜은 삼일제약에서 제공받은 것을 사용하였다. 이동상은 hexane (95% n-hexane), tert-Butylmethyl ether (99.8%, HPLC grade, Aldrich Chem. Co.), acetic acid (Baker analyzed, HPLC reagent)를 사용하였다.

Competitive bi-langmuir isotherm(1)을 구하는 흡착실험은 동적 방법 중 pulse method의 tR(retention time)과 dq/dC관계(2)를 사용하였다.  주입농도는 라세미 이브프로펜 20mg/□, 이동상유속은 1.5□/min로 고정하고 gradient mode를 이용하여 이동상 내에 라세미 이브프로펜의 농도를  1mg/□∼5.5mg/□로 0.5mg/□씩 증가시켜 체류시간의 변화를 측정하였다. 주입농도의 변화와 체류시간의 상관관계식을 얻기 위하여 isocratic mode에서 주입농도를 0.00016925g/□∼0.23695g/□로 증가시켜 체류시간의 변화를 측정하였고, 이동상 유속변화와 체류시간의 상관관계는 isocratic mode에서 0.1□/min∼10□/min까지 유속을 증가하여 실험을 수행하였다. 이동상 조성비 변화와 체류시간의 상관관계는 gradient mode에서 조성비의 변화에 따라 크로마토그램의 기준선이 안정화되는 시간을 확인한 후 실험을 수행하였다.

실험장치 중 UV detector는 데이터 모듈에 직접 연결되어 모듈에서 PC로 데이터를 전달해 주어 피크의 면적과 높이, 체류시간 등을 얻을 수 있게 하였다.

[eqn: q_i = { a_i,1 C_i} over {1+b_A,1 C_A +b_B,1 C_B }+{ a_i,2 C_i} over {1+b_A,2 C_A +b_B,2 C_B }]                  (1)

여기서 qi는 고정상에서 라세미 시료의 농도이고 Ci는 이동상에서 라세미 시료의 농도이며, CA와 CB는 이동상에서 단일 광학이성질체의 농도를 나타낸다. a, b, c는 흡착 매개변수를 나타낸다.

[eqn: t_R (C)=t_O (1+F { dq} over {dC } )]                             (2)

여기서 tR은 체류시간을 나타내고 tO는 dead time이며 F는 칼럼내의 고정상과 이동상의 부피비(상비)를 나타내고 여기서 dq/dC는 식 (1)을 미분한 값으로 표현된다.

결과 및 토론

Fig. 1에서는 식 (2)에서 실험으로부터 구한 dqi/dCi와 실험에 사용된 Ci값을  식 (1)로부터 유추된 competitive bi-langmuir isotherm의 미분식을 모델로 사용하여 비선형 최소자승법으로 fitting하였다. 결정계수(r2)가 0.99843으로 비교적 정확하였고 이로부터 유추된 등온흡착식의 매개변수 값을 구할 수 있었다. 이 값을 Fig. 1에 나타내었다. 그 결과 S-(+)-Ibuprofen의 등온 흡착곡선식은 Fig. 2로 나타내어지고 등온흡착식은 아래와 같다.

[eqn: q_i = { 1.94875 C_i} over {1+0.15395 C_A +0.22172 C_B }+{ 1.41843 C_i} over {1+0.00139 C_A +0.00067 C_B }]         (3)

Fig. 3에서는 이동상 유속이 0.1□/min∼10□/min로 증가시켰을 때 유속과 체류시간이 감소하는 상관관계식(4)을 나타내었다. r2가 0.999이상으로 매우 정확한 관계식을 얻을 수 있었다. 이 관계식은 시간에 따른 유속을 변화시키는 gradient program의 작성에 사용되면 원하는 시간대 얻고자하는 peak를 검출할 수 있으며 원치 않는 peak의 체류시간을 증가시켜 분리도를 증가시키는데 유용하게 사용될 것으로 예측된다.

[eqn: R_t =y_0 +A_1 exp(-x/t_1 )+A_2 exp(-x/t_2 )+A_3 exp(-x/t_3 )]            (4)

여기서 x는 이동상에 용해된 라세미 이브프로펜의 농도를 나타낸다. Fig. 4에서는 이동상 (hexane/tert-butylmethyl ether/acetic acid)에서 acetic acid를 0.1%로 일정하게 하고 t-BME의 조성비를 증가하였을 때 S-ibuprofen과 R-ibuprofen의 체류시간이 감소하는 관계식을 나타내었다. S-ibuprofen과 R-ibuprofen의 r2 은 각각 0.99996과 0.9976이다. 용액내의 n-hexane 의 조성비의 변화가 5∼90%로 변화함에 따라 S-ibuprofen의 체류시간은 11.6분에서 3.1분으로 R-ibuprofen은 17.4분에서 3.4분으로 감소됨을 알 수 있었다. 이 결과로부터 용매변화에 따른 정확한 체류시간을 예측할 수 있고 시간에 따른 이동상속도 변화와 함께 적절한 이동상 조성비의 변화는 Racemic ibuprofen의 향상된 분리도를 얻을 수 있을 것이다.  Fig. 5에는 일정유속(1□/min)과 일정용매비(hexane/ tert- butylmethyl ether/acetic acid: 75/25/0.1)에서 주입농도의 증가(0.00016925g/□∼0.23695g/□)에따른 체류시간의 감소를 상관관계식으로 나타내었다. 주입농도가 증가함에 따라 변화는 작지만 체류시간이 일정하게 감소하는 것을 알 수 있으나 Fig. 6에서 알 수 있듯이 농도의 증가가 비대칭도를 증가시킴으로 여기서 감소된 체류시간의 변화로는 등온흡착식을 구하는데 사용하기에 부적합하다는 것을 알 수 있었다.

위 결과로부터 고성능 액체 크로마토그래피를 통한 키랄 의약품의 광학분할과정에서 이동상 유속, 이동상 조성비, 주입 농도와 같은 조업조건의 변화가 분리하고자하는 물질의 체류시간 사이에 정확한 상관관계식을 나타내는 것을 알 수 있었고, 여기서 얻어진 관계식을 시간에 따라 변화시킨다면 원하는 시간에 크로마토그램을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 분리도를 향상시키는데 유용한 자료가 될 것으로 사료된다.

참고문헌

[1] Thomas E.B., Raymond P.W.S., "Chiral Chromatography" Chapter 8(1998).

[2] 현명호, □ LC에 의한 광학 이성질체의 분리□ , Chapter 2(1996).

[3] 송태호,서성섭,최민호,김영대,이중기,박달근, □키랄 고정상을 이용한 라세미 이브프로펜의 광학분할□,화학공학, 38, 373(2000).