기름으로 오염된 토양으로부터 원유분해 미생물의 분리동정 및 분해특성

오 경 택, 배 상 옥, 정 선 용

전남대학교 환경공학과

Isolation, Purification of Crude oil Degrading Microorganisms from Oil-contaminated Soil and Its Characterization of Degradation

Kyong-Taek Oh, Sang-Ok Bae, Seon-Yong Chung

Department of Environmental Engineering Chonnam National University

서론

해양유류유출 사고가 계속 증가하고 있는 추세이며, 유류제품 사용으로 인한 토양오염 사고 또한 빈번하게 발생되고 있다[1]. 해양유류유출 사고로 인한 문제점으로는 해양 생태계에 치명적인 영향을 주고, 인근 어민에게 막대한 어업 손실을 준다. 또한 해양유류유출 사고시 뿌려진 유처리제는 。API(American Petroleum Institute)가 낮은 Bunker-A, C와 같은 물질에서는 비중이 높아 서로 엉켜서 가라앉아 피해의 지속성을 갖게된다.

．。API = {141.5/(specific gravity @60 ◁)}１131.5 (water = 10。API)

． Specific Gravity(or g/cc) = 141.5/(131.5+。API)  [2].

또한 기름으로 한번 오염되면 수십 년까지 피해가 지속되기 때문에 환경영향평가를 지속적으로 해야한다[3]. 그리고 기름으로 인한 토양오염은 도시내 주유소와 지하 기름저장탱크의 유출로 발생하고 그 심각성이 해양오염에 못지 않다. 해양오염, 토양오염을 최대한 자연 상태로 회복시키기 위해서는 화학적인 방법보다 자연 치유에 가까운 미생물을 이용한 방법이 있다. 이 방법의 장점으로는 환경에 미치는 영향이 적으며, 사용 후 회수하지 않아도 되고, 2차적인 오염원으로 작용하지 않는다. 그러나 화학적 처리방법은 해양 생태계 및 토양 생태계를 파괴할 우려가 있기 때문에 사용에 있어서 많은 것을 고려 해야한다.

본 연구에서는 원유를 분해하는 미생물을 자연계로부터 분리하였고, 분리된 미생물을 동정하고, 그리고 원유 분해 특성에 관한 연구를 하였다.

실험 재료 및 방법

1. 분리동정

원유 분해 균주를 찾기 위하여 유류제품으로부터 오염 가능성이 높은 토양인 주유소 저장 탱크 주위의 토양, 자동차 정비소□세차장 주변의 토양, 그리고 광주 하수 종말 처리장의 활성오니 등을 사용하였다. 채취한 시료를 100□ 시험관에 일정량(10g 혹은 10□)을 취하고, C-배지액(배지 조성: Deionized Water, 1□; (NH4)2SO4, 5g; KH2PO4, 1g; K2HPO4, 2g; MgSO4·7H2O, 0.2g; NaCl, 2g; CaCl2, 10□; FeSO4·7H2O, 10□; yeast extract, 0.2g; trace elements solution(2□), pH 7.0. trace elements solution: 1mg, MoO3; 1mg, ZnSO4□7H2O; 7mg, CuSO4□5H2O; 0.4mg, H3BO3; 1mg, MnSO4□5H2O; 1mg, CoCl2□6H2O 1mg; NiSO4·7H2O, 1mg; Deionized Water, 1□) 100□를 넣어 심하게 혼합시킨 후, 약 10분간 실온에서 정치한 후, 상등액을 1□ 취하여 신선한 C-배지[4] 10□에 균원으로서 접종을 하였다. 이때 모든 배지에 Crude oil, Bunker-A, Bunker-C, 휘발유, 등유, 경유, 폐오일, 폐엔진오일을 탄소기질(LG-Caltex Inc., 여천)로 사용하여 검색하였다. 기질 1%, 35℃, pH 7, 150rpm으로 일주일간 건식배양(SW-90F, Sangwoo Scientific Co.) 하여 육안으로 성장이 확인된 시험관에 한하여 같은 배양조건에서 1% 균을 접종하여 배양을 2회 실시하였다. 배양이 끝난 후, Luria Broth(LB) 고체배지(배지 조성: Deionized Water, 1□; Trypton, 10g; Yeast Extract, 5g; NaCl, 10g; Agar, 1.5%)에 배양이 끝난 균을 도말하여 순수분리 하였다. 순수분리된 균을 Glycerol과 혼합한 후, -70℃에서 보관하고, 필요시 0℃에서 해동시켜 사용하였다. 분리된 균은 API 20E Kit(bioMerieux, Korea Reagents Co., LTD.)를 사용하여 동정하였다.

2. 최적 온도, pH, 기질농도

최적 온도조사에서는 25℃, 30℃, 35℃, 45℃, 최적 pH조사에서는 pH 5∼10, 그리고 최적 기질농도 조사에서는 원유를 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2% 농도로 하여 조사하였고, 4hr마다 배양액 일정량을 취하여 UV-흡광광도기를 사용하여 Optical Density(O.D.) 600nm에서 측정하였다.

3. 분해능 조사

본 연구에 사용된 분해능 방법은 chloroform-methanol 추출법(크로메타법)을 사용하였다. 먼저 500□-플라스크에 무기성배지(C-배지) 100□, 기질 1%, 균 1%를 접종하여 30℃, 120rpm에서 3일간 진탕배양을 한 후, chloroform-methanol 추출용매(3:1v/v) 30□를 첨가하여 교반한 후, 1500rpm, 7분간 원심분리를 실시한 후, 하층의 chloroform-methanol 층을 추출하여, 전량이 30□가 되게 추출용매로 조절한다. 잔존한 수분제거를 위하여 sodium sulfate를 넣어 수분을 제거하고 일정량을 취하여 휘발 후 잔존유분의 중량을 측정하였다.

4. BTX, n-Alkanes 기질 분해능 조사

분리된 균을 가지고 BTX, n-alkanes(C10∼C32)를 기질로 하여 분해능력을 조사하였다. 기질로 사용된 BTX, n-alkanes은 총 volume의 0.1%를 주입하고, LB 액체배지에서 10시간 전배양한 균주를 10□의 C-배지에 1% 접종하였다. 35℃, 150rpm에서 일주일간 건식배양 후, 600nm에서 O.D.를 측정하여 분해능을 조사하였다.

5. GC/FID 분석

n-C6∼n-C44 물질이 함유된 표준용액(Petrocol 2887, Cat. No 4-8882, SUPELCO) 1%와 LB 액체배지에서 10시간 전배양한 균 1%를 10□ C-배지에 접종하여 배양하였다. 배양시료는 chloroform-methanol(3:1v/v)로 추출하여 분해능을 GC/FID(GC 8000 TOP, CE instruments, Italy)로 측정하였다. 측정 조건: Petrocol 2887 Capillary column(5m×0.53mm ID, 0.5□ film), Initial Oven Temp.; 30℃, Final Oven Temp.; 280℃, Temp. Rate; 8℃/min, Injection□Detector Temp.; 280℃, Carrier Gas; N2-5□/min, Sample; 0.5□, Split:Splitless=51:1.

결과 및 토의

원유 분해 미생물을 분리한 결과 분해능력이 강한 3가지의 균주가 분리되었다. 이들을 strain A132, F721, F722로 명명하였다. 분리된 균주를 Bergy's manual of systematic bacteriology에 준하여 동정한 결과 strain A132는 Acinetobacter spp., strain F721, F722는 Pseudomonas aeruginosa로 각각 동정되었다. 그리고 온도를 달리하여 배양한 결과 strain A132, F722는 35℃, strain F721은 25℃에서 최적의 성장을 보였고, 각 pH에 대한 조사 결과를 보면, F721은 pH 9, 그리고 strain A132, F722는 pH 8에서 최적 성장을 나타내었다. 그리고 최적 농도 조사에서는 기질(원유)의 농도가 2%로 조사되었다.

원유 분해능 조사 결과를 Table 1에 제시하였다. Table 1의 결과에 따르면 strain A132가 30℃(기질농도 1%), 35℃(기질농도 1%), 35℃(기질농도 2%)에서 1.147 g/□/day, 0.883 g/□/day, 6.04 g/□/day로 다른 균에 비해 우수한 분해능을 나타내었다. Strain F721은 30℃(기질농도 1%), 25℃(기질농도 2%)에서 0.82 g/□/day, 1.603 g/□/day의 분해능이 조사되었고, strain F722는 30℃보다 35℃에서 더 나은 분해능을 보였으나, 기질농도의 변화에서는 별다른 차이를 보이지 않았다. 그리고 3가지 균을 혼합한 균을 이용하여 기질 1%, 30℃에서 3일 동안 배양한 것이 단일 균을 이용하여 동일 조건으로 배양한 것보다 더 높은 분해능(1.27 g/□/day)을 나타내었다.

원유에 함유된 물질인 BTX와 n-alkanes을 기질로 사용하여 균의 분해능력을 조사한 결과를 Table 2에 나타낸다. Table 2에 따르면 strain A132는 benzene과 n-C11∼n-C32까지 분해하는 것으로 조사되었고, strain F721, F722의 경우 n-C10∼n-C19, n-C23에서 분해능을 보였지만, strain F722이 strain F721보다 더 높은 분해능을 보였다.

현재는 n-alkane의 표준물질(C6∼C44)을 이용하여 이들 분해균들의 분해능력을 GC/FID를 이용하여 정성 및 정량분석을 진행하고 있다.

참고문헌

1. 강창구.: 첨단 환경기술(환경연구소)., 6-2, 2-15(1998).

2. htty://petro.kigam.re.kr/unit.htm.

3. Zhendi, W., Merv, F., and Gary, S.: Environ. Sci. Technol., 28,

1733-1746(1994).

4. Na, Kyung, Su., Lee, Yong, Woon., Lee, Jin, Sook., Lee, Jae, Suk., Kubo,

Motoki., and Chung, Seon, Yong.: Environ. Eng. Res., 3(2), 67-78(1998).

Table 1. Characterization of crude oil-degrading bacteria

Strain	T1) (℃)	pH	CS2) (%)	Degradation rate of crude oil(g/□/day)
				30℃-1%	OT3)-1%	OT3)-2%
Acinetobacter spp. A132	35	8	2	1.147	0.883	6.04
P. aeruginosa F721	25	8	2	0.82	0.593	1.603
P. aeruginosa F722	35	9	2	0.653	0.81	0.83
A132+F721+F722		8		1.27

1) : Temperature, 2) : Concentration of Substrate, 3) : Optimum Temperature

Table 2. Degradation of BTX and n-alkanes by isolated strains

Substrate Strain	A132	F721	F722
Benzene	+	-	-
Toluene	-	-	-
Xylene	-	-	-
n-C10	-	+	++
n-C11	+	+	+
n-C12	+++	+	++
n-C13	+++	+	+
n-C14	+++	+	+
n-C17	+++	+	+
n-C18	+++	+	++
n-C19	+++	+	++
n-C20	+	-	+
n-C22	+	-	-
n-C23	+	+	+
n-C28	++	-	-
n-C32	+	-	-

+ : good (O.D. ; 0.1 ∼ 0.4), ++ : better (O.D. ; 0.5 ∼ 1.0),

+++ : best (O.D. 〉1.0), - : no growth