곤충병원성 곰팡이 Beauveria bassiana 726의 생산배지 최적화와 포자생산

김병혁, 강성우*, 김승욱

고려대학교 화학공학과, 고려대학교 생명공학원*

Spore Production and Media Optimization for

Entomopathogenic Fungus, Beauveria bassiana 726

Pyong Hyok Kim, Seong Woo Kang*, Seung Wook Kim

Department of Chemical Engineering, Korea University,

Graduate School of Biotechnology, Korea University*

서론

근대 농업에서는 생산성 향상을 위해서 병충해 예방 및 잡초제거 목적으로 여러 가지 방제기술들이 사용되고 있으나 가장 일반적인 방법은 화학적 방제기술로서  다른 방제기술들에 비해 매우 경제적이어서 현재 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. 그러나 화학적 방제 기술은 수질오염, 수중생태계파괴 등 여러 가지 환경 문제를 유발시킬 뿐만이 아니라 화학적 살충제를 사용하면 할수록 해충의 살충제 내성이 더욱 증가하여 더욱 강력한 살충제를 사용하거나 잦은 방제를 통해 병충해를 조절해야하는 단점이 있다. 이러한 여러 가지 단점을 지닌 화학적 살충제를 대신할 수 있는 다른 방제기술로서 생물학적인 방제기술인 미생물에 의한 살충방법을 이용하면 이러한 문제점을 해결할 수 있다고 여겨진다.

곤충병원성 곰팡이를 이용한 생물학적인 방제기술의 장점은 인간과 고등생물, 어류, 곡물 등에 직접적인 피해와 위험물질의 축적 등과 같은 간접적인 위해요소가 없어 안전성이 높고, 목적하는 해충만을 선택적으로 방제할수 있는 점이다. 그리고 화학적 살충제와는 달리 살충효과가 지속되어서 반복적인 방제를 최소화 할수 있고, 곤충의 내성이 잘 유발되지 않는다는 점이다.

본 연구에서는 곤충 기생균을 미생물 살충제의 산업화에 이용하기 위한 대량배양기술을 확립함이 그 목적이다. 이를 위해서는 Beauveria bassiana 726의 성장조건을 확립하고 값싼 배지인 당밀을 이용한 생산배지의 최적화와 최적화된 배지에서 포자의 대량생산을 위해 교반식 반응기에서 회분식 및 유가식 배양을 수행하였다.

재료 및 방법

본 실험에 사용된 균주는 곤충 병원성 곰팡이의 일종인 Beauveria bassiana 726로서, 강원대학교 농생물학과로 부터 분양을 받았다. 균주 보관용 배지는 PDA (Potato Dextrose Agar)배지를 사용하였고, 종균배지로는 DP (2% Dextrose, 1% Bacto peptone)배지를 사용하였다.

PDA 사면배지에서 배양된 균체를 멸균수 10ml를 이용하여 포자와 균사체를 분리한 후 종균배지에 접종하여 조업부피가 100ml 되게하여 28℃, 180rpm으로 5일 배양하여 종균으로 사용하였다. 본배양은 250ml 삼각플라스크에서 조업부피가 50ml이 되도록 액체배지를 만들어 종균을 10%(v/v)로 접종한 후 28℃, 180 rpm으로 진탕배양하였다. 생물반응기 배양시 온도는 28℃, 배양액의 초기 pH는 5.0으로 맞추어서 300rpm, 1.0vvm의 조건으로 배양하였다.

본배양 기질로는 제일제당 인천공장에서 제공받은 당밀을 사용하였고 그 조성은 30-35% sucrose, 10-15% 전화당 (포도당과 과당), 그리고 시럽내의 고형분의 농도는 70%(w/w)이었고, 회분의 농도는 10.4%였다. 증류수를 이용하여 당밀을 4배로 희석하고 황산으로 pH 4.0으로 맞춘 후, 121℃, 1.5기압에서 30분간 열처리하였다. 열처리된 당밀을 15,000rpm에서 30분간 원심분리 후 얻어낸 농축액을 적절하게 다시 희석하여 사용하였다.

배양 후 균체량 측정은 50ml 배양액을 Whatman GF/C (47m□ Circles)를 이용하여 감압여과 후 증류수로 잔여 배지성분을 세척한 다음 70℃에서 overnight하여 dry cell weight로 측정하였다. 환원당과 sucrose의 농도는 Modified DNS Method (Miller, 1959)로 측정하였다. 포자농도는 혈구계수기 (Haemocytometer)를 이용하여 배양물내의 포자농도를 측정하였다.

결과 및 토론

Beauveria bassiana 726의 최적성장온도 결정실험에서는 23℃, 28℃, 33℃에서 균체농도가 각각 9.81, 17.61, 4.46(g/L)로 좋은 성장을 보였다.

초기 pH 영향을 조사한 결과 초기 pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0에서 최대 균체농도가 각각 3.24, 9.33, 4.96, 7.47, 5.72(g/l)로 초기 pH 5.0에서 가장 좋은 성장을 보였다. 따라서 최적 성장온도와 초기 pH는 28℃, 5.0으로 이후의 모든 배양에 적용되었다.

전처리한 당밀을 당농도가 1%, 2%, 3%, 4%가 되게끔 하고 bacto peptone 1.0%를 투입하여 배양한 결과 최대 균체농도와 포자농도면에서는 당농도가 2.0%인 경우에 각각 12.57g/L, 1.88×108/ml로 가장 좋은 결과를 보였다. 수율면에서는 당농도가 1%인 경우가 0.94 (g DCW/g carbon source)로 가장 높은 값을 보여주었다. 균체의 성장 모습은 육안으로도 잘 자랐음을 확인할수 있을 정도로 균체의 성장이 왕성하였다. 성장 초기에는 균체가 균사체 형태로 자랐지만 성장이 진행됨에 따라서 pellet형태로 성장함을 알 수 있었다. 균체의 수율은 1.0% 농도에서 가장 높게 나왔으나, 2%인 경우에서 최대의 균체와 포자농도를 보이고, 수율도 크게 차이가 없어 최적 초기 당농도는 2.0%로 결정되었다.

여러종류의 유기질소원 (bacto peptone, proteose peptone, corn steep liquor, yeast extract, hydrolyzed casein)을 1.0%로 첨가하여 영향을 살펴보았다. Hydrolyzed casein을 이용한 경우가 다른 유기질소원을 사용한 경우(10.8-14.3g/L) 보다 균체농도가 19.6g/L로 약 1.4-2.0배 정도 높았으나, 포자농도면에서는 corn steep liquor가 0.4×108/ml로 가장 높아 값이 싼 corn steep liquor를 대량배양에서의 경제성을 생각하여 질소원으로 채택하였다. 그리고 여러 가지 무기질소원의 영향을 살펴본 결과 첨가하지않은 대조구보다 균체농도와 포자농도에서 비슷하거나 낮아서 본 실험에서는 배제되었다. Corn steep liquor를 0.5-3.0% 농도로 첨가햐여 배양한 결과 모든 농도에서 거의 비슷한 균체농도(11.2-14.8g/L)를 보였지만 포자농도와 수율면에서는 0.5%에서 각각 0.76×108/ml, 44.6 (g DCW/g nitrogen source)으로 나타났다. 따라서 최적의 corn steep liquor 농도는 0.5%로 결정하였다.

다양한 무기염류를 0.1% 농도로 첨가하여 균체 성장과 포자의 생성을 관찰한 결과 대조구 보다 균체농도는 비슷하거나 저조하였으며 포자농도에서는 모두 낮았다. 무기염류 중에서도 K2HPO4와 KH2PO4를 첨가한 경우에서 균체농도가 각각 11.2, 9.2(g/L)로 높게 나타나 농도별로 조사하였다. K2HPO4와 KH2PO4를 각각 0.05-0.2% 농도별로 첨가하여 배양한 결과 균체농도와 포자농도는 무기염류의 농도에 따라 크게 변하지 않았지만 이중 가장 나은 균체의 생성과 포자의 생성을 보인 0.05% KH2PO4로 결정하였다.

최적화된 배지조성(2% total sugar, 0.5% corn steep liquor, 0.05% KH2PO4)을 이용한 삼각플라스크 배양에서 시간에 따른 profile은 Fig. 1과 같다.

약 50시간 정도에서 균체의 성장은 stationary phase에 도달하였고, 포자의 농도는 120시간 정도에서 최고의 농도를 나타냈다. 기질은 거의 시간에 따라 1차의 감소 경향을 보였고, 균체의 농도를 로그값을 취하면 시간에 따라서 3차의 경향으로 증가함을 알수 있었다(Fig. 2). 이를 토대로 기질의 감소와 비성장속도를 fitting한 결과 아래의 모델과 일치함을 알수 있었다(Fig. 3)

[eqn: mu = mu sub max e sup {-K sub s over s}]   s : Substrate concentration(g/L), □ : Specific growth rate

□max : Maximum specific growth rate(/hr), Ks : Utilization constant(g/L)

생물반응기(1.5L)에서 회분식 배양한 결과(Fig. 4), 기질은 약 72시간 정도에서 고갈됨을 알 수 있었다. 균체의 최고농도는 6.0g/L로 나타났고, 포자의 최고 농도는 2.80×108/ml로 나타났다. 균체의 농도는 삼각플라스크에서 실험했을 때에 비해 떨어졌고, 포자의 농도는 삼각플라스크에서 실험했을 때에 비해서 약 1.5배 정도 높게 나왔다. 기질의 감소 profile을 보면 대략 60시간 정도까지는 거의 시간에 따라서 1차로 감소함을 알 수 있었다. 회분식배양에서의 kinetic parameter를 결정하기 위해, 균체의 농도와 기질의 감소를 3차와 1차로 fitting하여 보았다(Fig. 5). 이를 통해 삼각플라스크 배양에서와의 같은 모델과 잘 맞음을 알 수 있었다(Fig. 6).

유가식 배양에서 10% 환원당만을 공급배지로 첨가한 경우 46.5시간째 기질의 농도를 원하는 농도로 유지하기 위하여 공급배지를 34ml 투입해 주었다. Fig. 7에서 보여주는 바와 같이 균체와 포자의 최대농도는 각각 5.5g/L, 1.7×108/ml로 회분식 배양에 비해 증가하지 않았다. 이를 통해 B. bassiana 726의 균체의 성장과 포자의 생성을 위해서는 질소원의 영향이 중요함을 확인할 수 있었다.

10% 환원당, 2.5% corn steep liquor, 0.5% KH2PO4를 포함한 공급배지를 사용한 유가식 배양의 결과를 보면(Fig. 8), feeding후 시간에 따라 계속적으로 균체의 농도 및 포자의 농도가 증가함을 알 수 있었다. 가장 높은 균체와 포자의 농도는 각각 12.7g/L, 5.4×108/ml이었다.

결론적으로 생산배지 최적화에서는 당밀과 corn steep liquor로 조성된 매우 값싸고 간단한 생산배지가 확립되었으며, 포자의 대량생산에는 회분식보다 탄소원과 질소원을 공급배지로 이용한 유가식 배양이 가장 우수하다는 결론을 내릴수 있었다.

참고문헌

1. Dubois, M., Gilles K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. and Smith, F. : Anal. Chem. 28(3), 350-356(1956)

2. Feng, M. G., Poprawski, T. J. and Khachatourians, G. G. : Biocontrol Sci. Technol. 4, 3-34(1994)

3. Havukkala, I., Mitamura, C., Hara, S., Hirayae, K., Nishizawa, Y. and Hibi, T. : J. Invertebr. Pathol., 61, 97-102(1993)

4. Miller, G. L. : Anal. Chem. 31(3), 426-428(1959)