Phellinus linteus의 액체배양을 위한 새로운 합성배지

최근호

대전산업대학교 화학공학과

A New Synthetic Medium Composition for the Submerged Culture of Phellinus linteus

Keun Ho Choi

Department of Chemical Engineering, Taejon National University of Technology

서론

새로운 항종양성 물질(antitumor substances)의 개발이라는 측면에서 담자균류로부터 항암효력과 면역 조절 효력을 갖는 다당류(polysaccharides)를 얻기 위한 연구가 진행되어 왔다. 표고버섯(Lentinus edodes)과 팽이버섯(Flamulina velutipes) 그리고 구름버섯(Coriolus versicolor)을 포함하는 십여 종의 버섯이 항암효력과 면역 조절 효력을 갖는 다당류를 갖고 있으며, 그러한 버섯으로부터 얻을 수 있는 항암효력과 면역 조절 효력을 갖는 다당류 중에서도 뜨거운 물과 알코올을 사용하여 상황(Phellinus linteus)의 균사체로부터 추출한 다당류가 쥐에 이식한 육종(sarcoma-180)에 대해 가장 효과적인 것으로 보고되고 있다[1].

그러나, Phellinus linteus의 자실체는 자연적으로 구하기가 대단히 어려워서 균사체를 인공적으로 액체배양하여 항암물질을 생산하고자 하는 노력[2,3]이 있어 왔다. Phellinus linteus 균사체의 대량 배양을 통하여 항암물질인 다당류를 경제적으로 생산하기 위해서는 새로운 배지의 개발이 필요하다. 따라서, 본 연구에서는 문헌에 나와 있는 배지들의 성능을 비교하여 배지의 성분이 어느 정도는 정해져 있는 기본배지를 우선 선정한 후에 기본배지에 들어 있는 성분들의 농도를 변화시키면서 실험하는 방법을 통하여 새로운 배지를 개발하였다.

실험

본 연구에서는 Phellinus linteus KCTC 0082BP 균주를 (주)한국신약으로부터 분양을 받아서 사용하였다. 백금이를 사용하여 PDA(potato dextrose agar) 배지 20 mL가 든 Petri dish의 중심부에 Phellinus linteus 균주를 접종하여 균사가 만연할 때까지(약 10일간) 배양기내(28±1 ℃)에서 배양한 다음에 균사가 만연한 Petri dish를 냉장고(4 ℃)에 보존하였다. 종균용 배지로는 이 등[2]의 연구에서 가장 좋은 균사 성장을 보여주는 것으로 밝혀진 GP배지를 사용하였다. 내경이 7 mm인 cork borer를 사용하여 냉장고에 보존중인 Petri dish로부터 균사가 자라고 있는 고체배지 조각을 떼어서 100 mL 종균용 배지에 접종하여 배양하였다.

액체배양 시에 접종되는 균체의 양을 항상 일정하게 유지하기 위하여, 자외선분광광도계(Spectronic 20D, Milton Roy Company)를 사용하여 종균배양액의 투광도와 건조균체량간의 관계를 구하였으며, 그 관계를 이용해서 건조균체량이 10 mg이 되도록 종균배양액(약 1.5 mL)을 취해서 미리 조제한 100 mL 액체 배지가 들어 있는 삼각 플라스크에 접종하여 배양하였다. 각 실험에 사용한 각종 배지들과 종균용 배지는 먼저 배지의 pH를 0.1 N NaOH 용액과 0.1 N HCl 용액을 사용하여 5로 조정한 후에 고압멸균기에 넣어서 121 ℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 그리고, 배양 시에는 플라스크 내에 직경이 16 mm인 유리 구슬 6개를 넣어서 배양액의 균체 농도가 균일하도록 하였다[4]. 각종 액체배지를 28±1 ℃와 150 rpm으로 유지되고 있는 진탕배양기에 넣고 3일간 배양하였다.

액체배양이 끝나면 배양액 10 mL를 취하여 3000 rpm으로 15분간 원심분리한 후에 상등액을 제거하고 가라앉아 있는 균체에 증류수 10 mL를 가하고 같은 조건에서 원심분리한다. 이런 과정을 한 번 더 수행한 후에 균사체가 들어 있는 튜브를 온도가 100±1 ℃로 유지되고 있는 건조기에 넣어서 24시간동안 건조시킨 다음에 식혀서 튜브의 무게를 측정하여 건조균체량을 구하였다.

실험결과 및 토의

균사의 성장속도에 대한 배양 온도의 영향을 알아내기 위하여, 내경이 6 mm인 cork borer를 사용하여서 냉장고에 보존하고 있던 Petri dish로부터 균사가 만연한 고체배지 조각을 떼어내어 PDA(potato dextrose agar) 배지 20 mL가 든 다른 Petri dish의 중심부에 접종한 후에 각각 온도가 일정하게 유지되고 있는 항온기 내에서 3일간 배양하여 colony의 직경을 측정하였다. 본 실험의 온도범위(20∼33 ℃)에서는 28 ℃의 배양온도에서 가장 큰 colony의 직경이 얻어졌다(Fig. 1). 이는 Phellinus linteus는 28 ℃에서 가장 성장속도가 빠르다는 것을 의미한다.

기본배지의 선정을 위하여 본 연구에서 제조한 2가지 배지와 다른 연구자들[2,3]이 제안한 배지들을 사용한 실험 결과(table 1)를 보면, 본 연구에서 제조한 배지1이 배지2나 다른 연구자들[2,3]이 제안한 배지들보다 좋은 균사성장을 보여줌을 알 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 배지1을 기본배지로 택하여 새로운 배지를 개발하는 실험을 수행하였다.

다른 성분의 농도는 기본배지와 같게 유지하고 1차인산칼륨(KH2PO4)의 농도를 0∼2.0 g/L로 변화시키면서 실험하였더니, 1차인산칼륨의 농도가 1.0 g/L일 때에 가장 많은 건조균체량을 얻을 수 있었다(Fig. 2). 1차인산칼륨의 농도를 1.0 g/L로 하는 한편, 1차인산칼륨과 염화칼슘을 제외한 다른 성분의 농도는 기본배지와 같게 제조한 배지를 사용하여 실험하였더니, 본 연구에서 실험범위(0∼0.5 g/L)에서는 염화칼슘의 농도가 0.1 g/L일 때에 가장 균사성장이 좋았다(Fig. 3). 배지 1L에 glucose 50 g, peptone 10 g, yeast extract 10 g, KH2PO4 1.0 g, CaCl2 0.1 g이 공통으로 들어 있을 때에는 본 연구에서 실험한 황산마그네슘7수화물(MgSO4·7H2O)의 농도 범위(0∼1 g/L)에서의 건조균체량은 황산마그네슘7수화물의 농도가 증가함에 따라서 점차 증가하는 경향을 보여주었다. 1 L의 배지내에 glucose 50 g, peptone 10 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4·7H2O 1.0 g, CaCl2 0.1 g이 들어 있는 배지를 사용할 때에 본 실험에서 실험한 농도범위(0∼15 g/L)에서는 효모추출물의 농도가 3.0 g/L일 때의 건조균체량이 가장 컸다(Fig. 4). 배지 1 L에 glucose 50 g, yeast extract 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4·7H2O 1.0 g 그리고 CaCl2 0.1 g이 공통으로 들어 있을 때에 본 연구에서 실험한 범위(0∼10 g/L)에서는 peptone의 농도가 증가할수록 건조균체량은 증가하였다. 배지 1 L에 peptone 10 g, yeast extract 3.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4·7H2O 1.0 g 그리고 CaCl2 0.1 g이 공통으로 들어 있을 때에 본 연구의 실험 범위(10∼90 g/L)에서 건조균체량은 포도당의 농도가 증가함에 따라서 증가하였다. 다른 성분들의 영향을 실험한 결과와 비교할 때에 건조균체량은 peptone과 glucose의 농도가 증가함에 따라서 보다 크게 증가하였다. 이것은 다른 성분에 비하여 peptone과 glucose의 농도가 균사 성장에 미치는 영향이 크다는 것을 의미한다.

지금까지 단지 기본배지에 들어있는 성분의 농도를 변화시키는 실험을 통해서도 14.51 mg/mL의 좋은 균사 성장을 보여주는 배지(table 2의 배지1)를 얻을 수 있었다. 그 배지에 가용성 전분과 corn steep liquor를 추가한 실험과 1차인산칼륨(KH2PO4)대신에 2차인산칼륨(K2HPO4)을 사용한 실험 그리고 다른 연구자들이 제안한 배지를 사용한 실험들의 결과를 table 2에 비교하였다. Table 2를 보면, 본 연구에서 개발한 새로운 배지(배지3)가 다른 배지들에 비하여 월등히 높은 균체성장(16.79±0.67 mg/mL의 건조균체량)을 보여줌을 알 수 있다.

참고문헌

1.	Ikekawa, T., M. Nakanishi, N. Uehara, G. Chihara, and F. Fukuoka: Gann, 59, 155(1968).

2.	Lee, J. H., S. M. Cho, K. S. Ko, and I. D. Yoo: Kor. J. Mycol., 23, 325(1995).

3.	정경수, 고경수, 한만우: 한국 특허공보 97-9150(1997).

4.	Song, C. H., C. H. Lee, J. H. Ahn, B. S. Hong, and H. C. Yang: Kor. J. Mycol., 23(1), 53(1995).

5.	Kim, H. K.: Master Thesis, Chung Nam Univ., Taejon, Korea(1994).

Table 1. Experimental results for the choice of a basic medium.

No. of medium	Composition of medium(per liter)	Dry weight of mycelium(mg/mL)	Ref.
1	glucose 50 g, peptone 10 g, yeast extract 10 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, CaCl2 0.1 g	12.4±0.80	This study
2	glucose 50 g, (NH4)2HPO4 2.3 g, KNO3 0.04 g, NH4NO3 4 g	3.49±0.28	This study
3	glucose 30 g, peptone 3 g, K2HPO4 10 g, MgSO4·7H2O 0.7 g	8.40±0.46	(12)
4	glucose 50 g, peptone 10 g, yeast extract 10 g, K2HPO4 0.5 g	11.78±0.67	(5)

Table 2. Dry weight of mycelium of Phellinus linteus grown in different culture

media.

No. of medium	Composition of medium(per liter)	Dry weight of mycelium(mg/mL)	Ref.
1	glucose 90 g, peptone 10 g, yeast extract 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1 g, CaCl2 0.1 g	15.06±0.83	This study
2	glucose 90 g, peptone 10 g, yeast extract 3 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4·7H2O 1 g, CaCl2 0.1 g	15.78±0.22	This study
3	medium 1+soluble starch 10 g	16.79±0.67	This study
4	medium 1+corn steep liquor 10g	14.75±0.98	This study
5	glucose 50 g, soluble starch 10 g, corn steep liquor 10 g, peptone 5g, yeast extract 5 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4·7H2O 0.3 g	12.84±0.19	(5)
6	glucose 50 g, peptone 10 g, yeast extract 10 g, KH2PO4 0.87 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, CaCl2 0.3 g	14.25±0.64	(8)