Serratia marcescens ATCC 27117 chitinase의 키틴 및 키틴유도체 가수분해에 의한 N-아세틸키토올리고당의 생성

손정우, 김선영, 박종원, 정호섭, 김광

동아대학교 화학공학과

Production of N-Acetylchitooligosaccharides by hydrolysis of chitin and chitin derivatives with chitinase from Serratia marcescens ATCC 27117

Jeong-Woo Son, Sun-Young Kim, Jong-Won Park,

Ho-Sup Jung, Kwang Kim

Dept. of Chemical Engineering, Dong-A University

서론

Chitin은 자연계에 셀룰로스 다음으로 광범위하게 분포되어 있으며, 곰팡이류의 세포벽, 갑각류를 포함하는 절지동물의 외골격과 선충류의 외피를 구성하는 불용성의 □(1→4) 결합의 N-acetyl-D-glucosamine(GlcNAc)의 균일한 고분자의 형태로 존재하고 있다[1]. Chitin은 생의학, 약리학, 농학 그리고 생물공학 분야에서 많은 관심을 끄는 고분자 물질이며, 그것의 올리고당 형태인 [(GlcNAc)n] (n=1-6)은 항균제, 항곰팡이제, 면역 촉진제, 진단시약, 식물의 성장촉진제 그리고 식품 첨가제등 특히 항종양성을 이용하는 의약과 농학분야에서 주목을 받고 있다[2, 3]. 이러한 올리고당은 일반적으로 산가수분해에 의해서 제조되어지지만 chitin을 분해하는 효소인 chitinase를 이용한 효소 가수분해에 의해서도 제조된다.

본 연구에서는 효소의 chitin 가수분해에 의한 N-acetylchitooligosaccharides의 효율적인 생산을 위해 Serratia marcescens ATCC 27117로부터 분리된 활성이 높은 chitinase를 사용하여 여러 가지 chitin성 기질과 반응시켜 생성되는 N-acetylchitooligosaccharides의 양을 분석하여 최적의 반응기질을 찾고자 하였으며, 또한 반응시간에 따라 생성되는 N-acetylchitooligosaccharides의 조성을 분석하여 우리가 필요로 하는 당을 생산하기 위한 최적 반응조건을 알아내고자 하였다.

재료 및 방법

1. 미생물 배양

본 연구에 사용된 미생물은 한국과학기술연구원 생명공학 연구소 유전자 은행(KCTC)으로부터 분양받은 Serratia marcescens ATCC 27117이며 chitin을 분해하는 효소인 chitinase를 발현하는 특성을 가지고 있다. 균주는 50 mL의 YEPD 배지(yeast extract 1%, pepton 2%, glucose 2%)를 포함하고 있는 250 mL Erlenmeyer flask에서 연속적으로 계대 배양되며, 이 때 배양조건은 30℃, 250rpm으로 항온조에서 교반 배양되었다.

2. 효소생산

효소생산을 위한 배지 100mL는 chitin 15g/L, yeast extract 0.5g/L, (NH4)2SO4 1.0 g/L 및 MgSO4 1.36g/L를 포함하고 있으며, 500 mL Erlenmeyer flask에서 30℃, 7일간 배양하여 발현시켰다.

3. Chitinase 활성측정

Chitinase 활성은 Ressig등의 비색법에 따라 540 nm에서 Elisa Reader(Anthos htⅢ, Anthos labtec. Instruments, Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 효소의 1 unit는 1시간 동안 1□mole의 GlcNAc(N-Acetyl-□-D-Glucosamine)를 가수분해할 수 있는 효소의 양으로 하였다.

4. Chitinase의 기질특이성

기질로서 각각 0.6%의 colloidal chitin, glycol chitin, CM-chitin 및 powder chitin 용액을 사용하여 37℃에서 연속적으로 chitinase(12 units)와 반응시켜 시간에 따라 생성된 올리고당의 □mole수를 Ressig의 분석방법에 의해 측정하였다.

5. Chitinase에 의해 생성된 올리고당의 분석

Chitinase에 의해 생성된 올리고당은 (GlcNAc)n (n=1-6)을 기준용액으로 하여 □Bondapak NH2 칼럼이 부착된 HPLC로 210 nm에서 UV detector로 검출하였으며, 이동상으로는 70:30의 acetonitrile-water 용액을 사용하였다.

결과 및 고찰

1. 기질에 따른 chitinase의 효소적 가수분해 특성

Colloidal chitin, CM-chitin, glycol chitin 및 powder chitin(purified 와 practical grade)을 기질로 선택하고, Serratia marcescens로부터 생산된 chitinase(12 units)로 기질과 반응하여 시간에 따른 올리고당의 생산능력을 측정하였다. Fig. 1.에서 보는 바와 같이 colloidal chitin을 기질로 사용했을 때 반응시간 2시간에서 가장 많은 양의 올리고당을 가수분해함을 알 수 있으며, 가수분해능력의 순서는 높은 순서대로 colloidal chitin, glycol chitin, purified powder chitin, powder chitin(practical grade) 그리고 CM-chitin의 순서였으며, 이때 올리고당의 생성량은 각각 4.33, 1.84, 1.03, 0.81 및 0.05□mole/mL 이었으며, 기질에 따른 상대 가수분해속도를 Table 1에 나타내었다.

Chitinase의 기질 가수분해 형태는 반응시작 20분 동안 급격히 기질을 가수분해하여 올리고당을 생성하고 2시간동안 지속적으로 기질을 가수분해하다가 2시간 이후에는 반응이 완전히 종결되어 더 이상 올리고당의 양이 증가하지 않음을 알 수 있었다.

2. HPLC에 의한 N-acetylchitooligosaccharides의 분석

각각의 기질에서 생성된 N-acetylchitiooligosaccharides의 조성 변화를 HPLC를 사용하여 210nm에서 UV로 검출하였다. Fig. 2.에서와 같이 CM-chitin과 powder chitin(purified)에서는 GlcNAc, (GlcNAc)3 및 (GlcNAc)4당이 검출되었고, powder chitin(practical grade)에서는 GlcNAc, (GlcNAc)2, (GlcNAc)3 및 (GlcNAc)6당이 colloidal chitin과 glycol chitin에서는 GlcNAc, (GlcNAc)2, (GlcNAc)3, (GlcNAc)4 및 (GlcNAc)6당이 검출되었다. Fig. 3.은 chitinase의 기질에 대한 반응활성이 가장 높은 colloidal chitin에서 시간에 따라 검출되는 올리고당의 생성량의 변화를 나타낸 것이다. GlcNAc, (GlcNAc)2, (GlcNAc)3 및 (GlcNAc)6당은 시간이 증가함에 따라 가수분해되어 나오는 양이 증가하였지만 (GlcNAc)4당은 반응시작 20분 동안 가장 많이 가수분해되어 나오다가 20분 이후에는 효소에 의해 완전히 분해되어 40분 이후부터는 전혀 검출되지 않았다. 그리고 올리고당의 중합도가 낮은 GlcNAc, (GlcNAc)2, (GlcNAc)3의 생성량이 많음을 알 수 있었다.

참고문헌

1. Chen, J. P., and M. S. Lee (1995), Enhanced production of Serratia marcescens chitinase in PEG/dextran aqueous two-phase systems, Enzyme Microb. Technol., 17, 1021-1027.

2. Aiba, S. (1994), Preparation of N-acetylchitooligosaccharides by hydrolysis of chitosan with chitinase followed by N-acetylation, Carbohydrate Research, 265, 323-328.

3. Shimoda, K., K. Nakajima, Y. Hiratsuka, S. I. Nishimura, and K. Kurita (1996), Efficient preparation of □-(1→6)-(GlcNAc)2 by enzymatic conversion of chitin and chito-oligosaccharides, Carbohydrate Polymers, 29, 149-154.

Table 1. Relative hydrolysis rates of various chitinaceous substrates by

chitinase from S. marcescens.

Substrate	Relative hydrolysis rate (%)
Colloidal chitin Glycol chitin Purified powder chitin Powder chitin (practical grade) CM-chitin	100 42.5 23.8 18.7 1.2