혼합배양법을 이용한 □-poly-L-lysine 분리 효율 증대

이갑배, 선흥석, 김광섭, 정흥조*, 박찬영

전남대학교 응용화학공학부, *서남대학교 화학공학과

The Enhencement of efficiency in □-poly-L-lysine separation

using a mixed culture

Garp Pe Lee, Heung Suk Sun, Kwang sub Kim, Heung Joe Jung*, Chan Young Park

Faculty of Applied Chem. Eng., Chonnam National University

*Dept. of Chem. Eng., Seonam University

서론

□-poly-L-lysine(□-PL)은 Streptomyces albulus(St.. albulus)가 생산하는 자연계의 필수 아미노산인 L-리신(L-lysine) 단량체로 이루어진 균질 선형 고분자(linear homopolymer) 물질이며, 현재 우리 나라를 비롯한 세계각국에서 천연 식품첨가용 항균물질로 등록되어 시판되고 있다. □-PL과 같은 단백질을 비롯한 생물공학제품 생산에 있어 분리·정제 공정은 생산원가의 상당부분을 차지하므로, 제품 생산시 분리·정제 비용을 절감하는 것은 생산원가를 절감하는 효과를 갖는다[1].

지금까지는 □-PL을 함유한  발효원액을 그대로 건조·분말화하여 시판하거나, 높은 순도가 필요한 □-PL 제품은 크로마토그래피를 이용하여 정제한다. 그러나 이 방법은 정제 비용이 많이 들뿐만 아니라 발효 원액을 그대로 건조시킬 경우 배지에 glycerol이나 glucose 성분이 남아 있어 별도의 처리 공정이 필요하므로 두 가지 이상 미생물을 발효에 이용하여, 한 미생물이 생산한 물질을 다른 미생물이 이용하도록 한 후  유용한 생산물을 얻어내거나, 그 배양액을 또 다른 미생물이 처리하도록 하는 혼합 배양 법이 널리 사용되고 있다. 따라서 St. albulus 와 혼합 배양할 수 있는 균주는 □-PL생산에 영향을 미치지 않으면서 glucose를 효율적으로 감소시킬 수 있는 미생물이 필요하다. 따라서 높은 glucose 전화율과 낮은 pH 저항성을 갖는 Zymomonas mobilis(Z. mobilis)균주를 St. albulus와 혼합 배양 할 균주로 선정하였다. Z. mobilis는 gram-negative 균주로서 혐기적 조건 및 호기적 조건하에서 glucose를 에탄올로 발효시킬 뿐만 아니라 낮은 pH에 저항성을 갖는다 [2] 또한 yeast 보다 glucose 전화율이 높아 최근 관심이 집중되고 있으며[3-5] 빙초산 생산시 Acetobactor와 혼합 배양하여 glucose를 95.5%이상 acetic acid로 전환시키는 연구 등이 이루어지고 있다[5].

본 연구에서는 □-PL 분리 정제시 문제가 되는 glycerol 이나 glucose를 배양액으로부터 제거하여 □-PL 분리 효율을 향상시키려고 St. albulus와  Z. mobilis 혼합 배양 시기가 glucose 함량  및 □-PL 생산에 미치는 영향을 조사하였다.

실험

1. 사용균주 및 배지

본 실험에 사용한 □-PL 생산 균주는 일본 국립 생명 공학 연구소(NIBH, National Institute of Bioscience and Human Technology, Tsukuba, Japan)에서 분양 받은 Streptomyces albulus spp. lysinopolymerus[No. 346](St. albulus)를 사용하였으며  glucose를 배양액으로부터 제거할 균주는 Zymomonas mobilis subsp.[KCTC 1535](Z. mobilis)를 사용하였다. St. albulus 배양에 사용한 배지는 Shima 등[6]이 제시한 균체성장배지(glycerol 50g, (NH4)2SO4 10g, yeast extract 5g, MgSO4□7H20 0.5g, FeSO4□7H2O 0.03g, ZnSO4□7H2O  0.04g, 0.02M KH2PO4-Na2HPO4(pH=6.8) 1□)을 사용하여 사면배지에서 30℃로 48시간 동안 배양한 후 2번 계대 배양하여 5℃로 보관하였다. Z. mobilis 배양에는 yeast extract 5.0g, glucose 20g, 증류수 1□을 사용하여 사면배지에서 30℃로 24시간 동안 배양한 후 5℃로 보관하였다.

2. 혼합배양

St. albulus 배양은 500□ 삼각플라스크에 균체 성장 배지 100□를 채우고 선 배양한 St. albulus 1%를 접종하여 150rpm으로 조정된 진탕배양기(Shaking Incubator, KMC-8480S, Vision Inc.)에서 30℃로 24시간 배양한 후 대수기에 접어든 균주를 여과하여 멸균 증류수로 3회 세척한 St. albulus 세정균체를 마련하였다. 이 St. albulus 세정 균체를 □-PL생산배지(glucose 20g, (NH4)2SO4 10g, citric acid 20g, 증류수 1□(pH=4.2)) 100□에 희석하여 균체 성장 배지와 동일한 조건으로 배양하였다.

Z. mobilis은 250□ 삼각 플라스크에 50□배지를 채운 후 150rpm으로 조정된 진탕배양기를 사용하여 30℃로 24시간 배양한 후, 3000rpm으로 15분간 원심분리하여 Z. mobilis 균체만을 모아서 St. albulus와 혼합 배양할 접종원으로 사용하였다.

혼합배양 조건은 St. albulus를 □-PL생산배지에 접종후 계속 배양하면서 Z. mobilis 접종원을 동시 접종, 1일후 접종, 5일후 접종, 10일후 접종하여 배양액내에 남아있는 glucose 함량과 □-PL함량을 측정하였다.

3. 분석방법

St. albulus 배양액 내에 생산된 □-PL을 정량분석하기 위해 Itzhaki의 분석법을 이용하여 검량곡선을 만들었는데[7] 표준 시료는 Poly-L-lysine(Sigma Co.)을 증류수에 녹여 준비하였다. 1mM 메틸오렌지2□, 시료 2□씩 첨가해 실온에서  30분간 방치한 후 3000rpm으로 10분간 원심 분리하여 침전시키고 상등 액을 취한 후 분광광도계(Spectronic 20, Miltron Co.)를 이용하여 465□ 파장에서 흡광도 변화를 측정하였다. St. albulus 배양액에 남아있는 glucose양은 DNSA법[8]으로 정량 하였다.

결과 및 고찰

1. St. albulus와 Z. mobilis 혼합배양 시기가 □-PL생산에 0-15일간 미치는 영향

Z. mobilis 접종시기가 □-PL생산에 0-15일간 미치는 영향을 조사하였다. St. albulus와 Z. mobilis 접종시기가 □-PL생산에 0-15일간 미치는 결과를 Fig1에 나타내었다. Z. mobilis와 St. albulus를 동시에 접종한 것은 □-PL축적량이 10일째까지 St. albulus만을 배양한 경우(control)와 비슷한 축적량이었으나 15일째에 이르러서 □-PL생산량이 급격히 감소하였다. Control은 □-PL 축적량이 배양 15일째에 545mg/ml였으나 동시 접종한 경우 404mg/ml로 약 36%정도 □-PL생산량이 적었다.

Z. mobilis를 1일째 접종한 것은 배양 5일째에 접어들면서 control보다 약 28%정도 더 많은 □-PL 생산량을 보였으나 10일째에는 control과 같은 양이었고 15일째에는 control 보다 17%정도 적었다. 이는 St.  albulus가 배양 초기에 □-PL을 생산하는 과정에서 Z. mobilis가 □-PL을 더 많이 생산하도록 하는 자극제로 작용하여 5일째까지 활발히 □-PL을 생산한 것으로 보인다. 그러나 Z. mobilis가 사멸하는 과정에서 Shima등[9]이 보고한 항균 작용으로 배지 내에 생산된 □-PL이 Z. mobilis 세포벽에 달라붙어서 □-PL 함량이 점차 감소된 것 같다. 또한 Z. mobilis가 배양 5일에서 10일째 사이에 glucose를 거의 소모시켜서 배양 10일 이후에는 St. albulus가 glucose를 □-PL로 전환시키지 못한 것으로 여겨진다. 표 1에서 보는 바와 같이 1일째 Z. mobilis를 혼합 배양한 것은 배양 10일 후부터 Z. mobilis가 모두 사멸했는데 이는 극히 낮은 glucose 농도와 높은 □-PL농도로 인하여 모두 사멸한 것으로 보인다.

그러나 5일째 Z. mobilis를 접종한 것은 초기에 Z. mobilis가 자극제로 작용하여 □-PL이 Z. mobilis 세포 표면에 전기적인 흡착을 하여 세포벽을 벗겨내는 항균 작용(9)을 유도하기 위해 St. albulus가 □-PL을 활발히 생산하다가 Z. mobilis를 동시접종, 1일째 접종한 것과 마찬가지로 배양 10일 이후에는 Z. mobilis 모두 사멸하였다. 따라서 St. albulus 배지에 존재하는 glucose 소모량이 Z. mobilis를 동시접종, 1일째 접종한 것보다는 상대적으로 적었기 때문에 St. albulus가 □-PL을 control과 같은 양 생산할 수 있었던 것으로 여겨진다.

10일째 Z. mobilis를 접종한 경우는 배양 15일째까지 control과 같은 □-PL 생산량을 보였는데 이는 높은 □-PL 함량 때문에 Z. mobilis를 10일째 접종하자마자 모두 사멸하여 St. albulus 균주가 □-PL을 생산하도록 자극을 주기 못했기 때문인 것 같다.

2. St. albulus와 Z. mobilis 혼합배양 시기가 glucose 함량에 0-15일간 미치는 영향

St. albulus와 Z. mobilis 혼합배양 시기가 glucose 함량에 0-15일간 미치는 영향을 조사하였다. St. albulus와 Z. mobilis 혼합배양이 0-15일간 glucose함량에 미치는 결과를 Fig.2에 나타내었다. Control의 경우 초기 glucose 함량이 20g/L였다가 점차 감소하여 15일째에는 7.6g/L로 서서히 감소하였다.

Z. mobilis를 동시 접종하거나 1일째 접종한 경우는 혼합배양 5일째까지 glucose 함량이 control과 비슷한 경향을 가졌으나 혼합배양 10일째에 이르러 급격히 glucose 함량이 각각 2.1g/L와 2.5g/L까지 감소했다가 15일째에 이르러 0.3g/L까지 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 St. albulus와 Z. mobilis가 영양분을 서로 차지하기 위해 경쟁적으로 먹이 경쟁을 한 탓으로 보이며 낮은 □-PL농도에서 Z. mobilis가 10일째까지 살아남음으로서 다량의 glucose를 소모한 탓으로 여겨진다.

5일째 Z. mobilis를 접종한 경우 5-10일째에 이르러 12.6g/L에서 6.5g/L까지 감소하였다가 15일째에는 2.6g/L까지 감소했다. 이는 Z. mobilis를 동시 접종하거나 1일째 접종한 것보다 상대적으로 높은 □-PL 농도로 인하여 Z. mobilis 균주 상당수가 세포벽이 파괴[9]되어 사멸한 것으로 여겨진다.

10일째 Z. mobilis를 접종한 것은 glucose 함량이 control과 비슷한 양상으로 감소했다. 이는 배양 10일째에 접어들면서 높은 □-PL  농도로 인하여 Z. mobilis 균주 대부분이 세포벽 손상을 입어 죽게 되어 glucose 함량에는 영향을 주지 않은 것 같다.

결론

배양액으로부터 항균물질인 □-PL을 분리하고자할 때 배양액의 glycerol이나 glucose를 배양액으로부터 제거하여 □-PL 분리 효율을 향상시키고자 하였다. St. albulus와  Z. mobilis를 혼합 배양할 때 Z. mobilis 접종시기가 배양액내에 생성된 □-PL양과 남아있는 glucose 양에 미치는 영향을 조사하였다.

1. St. albulus를 5일 이상 배양한 후, Z. mobilis를 접종한 경우 control과 동일한 □-PL을 생산하였다.

2. Z. mobilis를 St. albulus와 동시에 접종하거나 1일후 접종한 경우 배양액에 남아있는 glucose량이 0.3g/l까지 제거되었다.

3. 배양액으로부터 항균물질인 □-PL을 분리하고자할 때, □-PL 생성량을 감소시키지 않고 배양액으로부터 남아있는 glucose을 제거하려면 St. albulus를 5일간 배양한 후 Z. mobilis 접종한 경우가 가장 효과적이었다. 이때 □-PL 생성량은 545mg/ml였고 남아있는 glucose양은 2.6g/L이었다.

참고문헌

1. 구윤모 : 생물공정 연구의 최근 동향, 생물공정 연구센터 발행, 55(1993).

2. Kondo, T. and M. Kondo: J. Ferment. Bioeng., 81(1), 42(1996).

3. Weuster-Bolz, D.: J. Microbiol. and Biotech., 39, 679(1993).

4. Siva Kesava, S., S.K. Rakshit and T. Panda: Press Biochemistry, 30(1),

41(1995).

5. Oda, Y. and K. Tonomura: J. Food Sci., 59(1), 171(1994).

6. Shima, S. and H. Sakai: Agric. Biol. Chem., 45(11), 2497(1981).

7. Ruth, F. and Itzhaki: Anal. Biochem., 50, 569(1972).

8. Mandels, M. L. Hontz and J. Nitrom: Biotech.. and Bioeng.,

16, 1471(1974).

9. Shima, S., Y. Fukuhara and H. Sakai: Agric. Biol. Chem., 46(7), 1917(1982).

Fig.1. The effects on production of   □-PL in a mixed culture of          St. albulus and Z. mobilis.

Fig.2. The effects on glucose concentration in a mixed culture of St. albulus and Z. mobilis.

Table1. The number of Z. mobilis(×106) in the various inoculaton time.

inoculation time culture time	simultaneous inoculation	inoculation after 1day	inoculation after 5days	inoculation after 10days
0 day	+++++*
1 day	+++++	+++++
2 days	++++	++++
3 days	+++	++
5 days	++	++	+++++
6 days	++	+	+++
7 days	+	+	++
8 days	-	-	+
9 days	-	-	+
10 days			-	+++++
11 days			-	+

*  The mean of "+" is 50 colony forming unit(C.F.U).

**  The mean of "-" is no colony forming unit(C.F.U).