pH shock  최적화를 통한 kasugamycin 생산성 증진

김창준, 장용근, 전계택*

한국과학기술원 화학공학과 및 생물공정연구센터, 강원대학교 생명과학부*

Enhancement of kasugamycin production by optimization of pH-shock interval

Chang Joon Kim, Yong Keun Chang, and Gie-Taek Chun*

Department of Chemical Engineering and BioProcess Engineering Research Center, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Taejeon 305-701, Korea

*Division of Life Science, Kangwon National University, Chunchon 200-701, Korea

서론

지금까지 미생물 발효에 의한 이차대사산물 생산에 대한 활발한 연구를 통해 많은 진전이 있어왔다. 이들 연구의 대부분은 생리학적 연구에 주안점을 두었는 바, 많은 연구자들이 이차대사산물 생산에 대한 영양성분들의 영향을 강조하여 왔다. 일반적으로, 세포생장속도가 감소하거나 혹은 특정 영양소원(탄소원, 질소원, 인원)이 결핍될 때 이차대사산물의 생합성이 활발히 개시된다고 보고되어왔다. 최근에는, 분자생물학의 급속한 발전에 힘입어 많은 관심의 대상인 방선균의 이차대사 경로에 작용하는 유전자 발현등에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다(1).

이러한 많은 연구결과에도 불구하고, 영양원 이외의 인자에 의한 이차대사산물 생성 촉진에 대한 보고가 거의 전무한 실정이다. Doull 등 (2)은 heat shock에 의해 jadomycin 생합성이 촉진된다고 보고하였으나, 생합성된 산물의 농도가 30 mg/□로 상당히 낮은 편이었다.

본 연구는 아직까지 보고된 바가 전혀 없는 pH shock에 의한 이차대사산물의 생합성 촉진에 관한 것으로써, pH shock을 가하는 시간을 최적화함으로써 S. kasugaensis에 의한 kasugamycin의 생산성을 극대화하는 것을 목적으로 하였다. Kasugamycin은 aminoglycoside 계열의 물질로써 도열병 방제제로 사용되고 있다.

실험

1. 균주 및 배지

본 연구에서는 한국미생물보존센터에서 분양받은 Streptomyces kasugaensis(KCCM 11390)을 생산균주로 사용하였다. 사용된 생산 배지의 조성(g/□)은 다음과 같다: maltose 30, glycine 10, K2HPO4 1.4, NaCl 1, CaCl2 0.1, trace salt solution 2 %(v/v).

2. 배양방법

-70oC에 보관된 30 % glycerol stock을 YM broth(Difco laboratory, USA) 100 □가 담겨진 500 □ 플라스크에 접종하여 29oC, 200 rpm에서 60시간 전배양 후 생산배지가 담겨진 생물반응기에 10 % 접종하여 발효를 시작하였다.

3. 분석방법

발효액 중의 세포농도는 건조균체중량(dry cell weight)을 통해 측정하였다. 기질 및 생성물 농도는 발효액을 원심분리하여 얻은 상등액 중의 농도를 측정하였다. 말토스는 DNS 방법에 의해 그 농도를 측정하였고 kasugamycin은 HPLC(Hitachi, Japan)를 이용하여 분석하였다.

결과 및 토론

중성조건에서의 세포배양 시 kasugamycin 생합성은 세포 생장이 멈춘후 부터 생산이 개시되는 전형적인 이차대사산물의 생합성 특성을 나타내었다. 후속 실험으로서, 중성조건에서 세포배양을 시작하였고, 배양 개시 후 36시간째 pH를 산성조건(3.5-4.0)으로 급격히 감소시켰다. 이러한 산성조건 하에서 48시간을 더 배양한 후 pH를 다시 중성조건으로 바꾸어 배양을 계속하였다. 세포 배양 단계에서 이러한 급격한 pH 강하를 통해 세포에 stress를 주는 운전방식을 pH shock이라고 정의하였다 (4). 두 경우의 실험결과를 표 1에 요약 비교하였다.

Table 1. Comparison of cultures at neutral pH and with pH shock

Culture	Final cell mass (g-cell/□)	Final kasugamycin (mg-KSM/□)	Yp/x (mg-KSM/ g-cell)	Yx/s (g-cell/ g-maltose)	Yp/s (mg-KSM/ g-maltose)	Qp (mg-KSM/ (□·hr))	qp (mg-KSM/ (□·hr·g-cell))
Aa	9.8	12	1.7	0.39	0.4	0.11	0.02
Bb	11.0	116.4	11.4	0.38	3.9	0.71	0.07

aCulture cultivated at neutral pH.

bCulture with pH shock.

최대 세포농도 및 세포수율(Yx/s)은 거의 비슷한 값을 보였으나, pH shock을 받은 경우 kasugamycin 수율(Yp/s) 및 specific kasugamycin production(Yp/x)은 중성조건에서 배양한 경우에 비해 각각 9.8배 및 6.7배 높은 값을 보였다. 또한 공정 효율지수인 부피생산성(Qp)과 비생산성(qp)은중성에서 배양한 경우에 비해 각각 6.5배와 3.5배 높은 값을 나타내었다. 한편, HPLC diagram을 비교한 결과 중성에서 배양한 경우에는 부산물 및 kasugamycin 유사물질이라고 추측되는 물질이 다량 생성된 반면, pH shock을 가한 경우에는 이에 해당하는 물질이 상대적으로 감소하였고 대신 kasugamycin이 다량 관찰되었다. 비생장속도(□)는 pH shock을 받기 전 0.1hr-1에서 받은 후 0.04 hr-1로 감소하였다.

이러한 결과로부터 pH shock에 의한 kasugamycin 생합성 향상은 그 자체 효과는 물론, pH shock에 의한 세포생장속도 감소와 결합되어 나타나는 것으로 판단된다. 즉, 세포내의 kasugamycin 생합성 유전자를 자극함으로써 생합성에 관여하는 효소들의 발현을 유도 하거나 혹은 이들이 derepression되는 것으로 추론된다.

다음은 최적 pH shock 시간을 결정하는 실험을 수행하였다. 모든 경우는 pH shock을 받은 후 일정시간 동안 세포 생장이 정지되는 lag phase를 보인후 다시 생장기에 접어들었다. 특히, pH shock을 24시간 및 48시간동안 받은 경우에는 pH shock을 받은 직후 세포농도가 일정시간 감소함은 물론 오랜 lag phase를 보인 반면, 6시간 및 12시간 동안 pH shock을 받은 경우에는, 위의 두 경우보다 짧은 lag phase 동안 세포생장이 멈추었다가 다시 생장기로 접어들었다. 모든 경우에 pH shock을 받은 후 일정시간이 경과한 다음 세포의 생장이 재개되는 시점부터 kasugamycin의 생합성이 시작되는 거동을 보였다. 상기 각 경우의 실험에서 얻어진 결과를 Table 2에 요약 비교하였다.

최대세포 생장은 13.2-16.5 g/□, 세포 수율(Yx/s)은 0.46-0.57로 큰 차이를 보이지 않은 반면, kasugamycin 수율(Yp/s) 및 specific kasugamycin(Yp/x)은 커다란 차이를 보이는 것이 주목된다. 24 시간일 경우 Yp/x와 세포생장이 모두 높아 결과적으로 생산성이 가장 높았다. 즉, pH shock 시간이 너무 짧으면 pH shock에 의해 세포 대사가 일부 이차대사산물 생합성 상태로의 전환은 되지만 일차대사 또한 활발하여 그 대사산물들이 생합성에 필요한 효소들을 repression 하는 것으로 추론된다. 한편, 필요 이상의 시간 동안 pH shock을 가하면 세포의 일차대사는 물론 이차대사에까지 악영향이 미쳐 오히려 kasugamycin의 생산성이 감소하는 것으로 추측된다.

Table 2. Comparison of cultures with different pH-shock intervals.

pH-shock interval (hrs)	Final cell mass (g-cell/□)	Final kasugamycin mg-KSM/□)	Yp/x (mg-KSM/ g-cell)	Yx/s (g-cell/ g-maltose)	Yp/s (mg-KSM/ g-maltose)	Qp (mg-KSM/ (□·hr))	qp (mg-KSM/ (□·hr·g-cell))
6	15.6	58.6	4.2	0.57	2.0	0.33	0.02
12	13.2	77.5	5.9	0.46	2.7	0.54	0.04
24	16.5	182.6	11.9	0.57	6.2	0.72	0.05
48	14.8	120.2	8.6	0.52	4.2	0.56	0.04

결론

본 연구에서는 pH shock에 의해 이차대사산물인 kasugamycin 생합성이 촉진되는 것을 발견하였다. 또한 pH shock 시간을 너무 짧게(6, 12 시간) 하면 세포가 잠재적으로 내포하는 생합성 능력을 충분히 발현하지 못하였고, 너무 오랜 시간(48 시간) 동안 가하여도 세포의 생합성 능력이 저하되는 것을 관찰하였다. 결과적으로 24시간이 최적 pH shock 시간이었고, 이때 생성된 kasugamycin 양이 최대인 것으로 나타났다.

참고문헌

1. Doull, J.L, and Vining, L.C. Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 449(1990).

2. Doull, J.C., Ayer, S.W., Singh, A.K., and Thibault, P., J. Antibiot., 44, 869(1993).

3. Ichikawa, T., Date, M., Ishikura, T., Ozaki, A., Folia-Microbiol., 16, 218(1971)

4. 김창준, 장용근, 전게택, 사단법인 한국생물공학회 □97 생물화공 연구결과 발표 및 1998년도 추계학술대회발표대회, 219(1998).