PE 담체에 Pseudomonas.stutseri 흡착특성

차성철, 신민수, 최호석, 이일*, 구본탁*

충남대학교 공과대학 화학공학과, (주)한국미생물 기술*

Adsorption Charateristics of Pseudomonas.stutseri in PE Biocarrier

Sung-Chul Cha, Min-Su Shin, Ho-Suk Choi, Il Lee*, Bon-Tag Koo*

Dept of  Chem Eng., College of Eng., Chungnam National University

Korea Microbial Technology, Inc.*

서론

살아있는 미생물을 담체에 고정시켜 생물학적 촉매로 활용하는 기술은 미생물 산업을 발전시키는데 큰 기여를 하였다. 이런 미생물 고정화 기술은 기존의 효소 고정화 기술에 비해서도 경제성면에서나 생물 반응계의 안정성 측면에서도 우수한 장점이 있다. 무엇보다도 고정화된 미생물을 통한 지속적인 효소의 자체 재생과정은 효소의 추가적인 주입이 필요 없기 때문에 효소 고정화기법보다 우수하다. 그러나, 연속 공정에 장시간 적용할 때 효과적인 미생물 고정화와 조업의 안정성을 높이기 위해서는 적합한 미생물 고정화 기술뿐만 아니라 우수한 담체의 선정이 매우 중요하다. 따라서 본 논문에서는 경제적 측면과 실용적 측면을 고려하여 PE를 담체로 사용하였으며, 미생물의 부착 특성을 높여주기 위해서 PE에 화학적 표면처리를 가했다. 즉, 소수성이 강한 플라스틱 표면에 친수성을 부여하고 표면전하를 증가시켜 정전기적인 반발력을 감소시킴으로써 미생물 부착의 친화성(affinity)를 증가시키는 양이온(cation) 처리법을 도입하여 미생물 부착 효율을 비교·관찰하였다.

본론

1.미생물 담체의 선정

미생물 고정화 담체 선정시 고려해야될 가장 중요한 기준 중의 하나는 담체가 미생물에 독성을 가지고 있지 않아 미생물 대사에 영향을 주지 않아야 한다는 것이다. 사실 이론적으로는 세포막의 투과성을 향상시켜 세포의 대사작용을 항상시키는 담체를 발견할 수도 있지만, 실제로는 미생물과 담체간의 조화로운 환경을 제공하는 것이 최소한의 기준이 된다. 두 번째 기준은 담체의 미생물 고정화 능력이다. 즉, 담체는 가능하면 단위 면적당 많은 미생물들을 고정화 시켜야 한다. 담체의 고정화 능력은 담체의 단위질량당 미생물의 건조무게([eqn: g/m sup 2])로써 측정된다. 담체의 미생물 고정화 능력은 흡착과정 후에도 담체와 비가역적으로 흡착되어 있는 미생물의 양의 많고 적음으로 판별할 수 있다. 담체에 미생물을 많이 고정시키기 위해서는 폴리사카라이드나 콜라젠 형태의 겔에 미생물을 가두어 놓는 방법이 있으나, 제조과정의 어려움과 담체의 강도가 약한 단점이 있다. 한편, clay나 규사와 같은 무기 담체도 생물막 여과공법등에 많이 사용되고 있다.

효소의 고정화는 고정화된 효소의 양이 증가할수록 더욱 좋은 활성을 얻는 반면에 미생물 고정화는 담체와 미생물 간의 상호작용력이 인력으로 작용하도록 배지의 환경과 담체의 표면성질 등을 향상시키는 것이 중요하다. 한편, 미생물 기술에 담체를 적용하기 위해서는 전체 과정에서 담체의 멸균 공정을 고려해야 한다. 따라서, 담체는 멸균 온도에서 열에 안정한 성질을 가지고 있어야 하며, 전체 공정의 pH범위에서 안정해야 한다. 또한, 미생물에 기질이 잘 확산될 뿐만 아니라, 미생물 고정화 능력을 향상시키기 위해서 담체의 표면적(공극률)을 증가시키는 것도 필수적이다. 고압에서 안정하여야 하고 반응기 조업을 수월하게 하여 미생물의 먹이가 잘 전달될 수 있도록 담체의 모양과 크기를 설정하는 것이 좋다. 끝으로 담체는 가격이 저렴하고 재생 가능한 것이 좋다.

2.실험

2.1. 담체의 화학적 에칭

담체의 재질로는 LDPE, LLDPE판을 직육면체(2 × 10 ×10 mm)모양으로 만들어 사용하였다. 실험방법으로는 담체 표면의 처리로서 3단계의 과정을 거쳤다. 첫 번째 단계로 10mM의 ferric chloride 용액에 담체를 넣고 30℃에서 3시간 동안 강하게 교반시켰다. 담체를 꺼내어 일정량의 증류수로 세척한후 1시간동안 건조시켰다. 그 다음은 polycation 처리로 PEI 처리 용액은 5% PEI 수용액 (PH 7)에 10% trimethylamine 용액을 같은 부피로 혼합하여 처리 용액을 제조하였다. 이 용액에 전처리된 담체를 넣고 30℃에서 강한 교반하에 30시간 동안 반응시킨후 담체를 꺼내어 세척하고 1시간동안 건조시켰다. 다음은 담체 표면의 chemical etching 단계로 Chromic acid 처리는 담체를 처리 용액[eqn: rm [K SUB 2 Cr SUB 2 O SUB 7 ~:~ H SUB 2 O ~:~H SUB 2 SO SUB 4 ~:~ = 4.4 ~:~7.1 ~:~ 88.5(w/v) ]]에 넣고 60∼70℃를 유지하면서 교반하에 반응시켰다. Chlorsulfonic acid 처리는 처리 용액[eqn: rm [ClSO SUB 3 H ~:~CCl SUB 4] [eqn: rm = ~ 2 ~:~1(w/v)]]에 담체를 넣고 실온에서 교반하에 4시간 동안 반응 후 담체를 꺼내어 증류수로 세척하였다. 따라서 각각의 담체재질에 대한 시판의 종류는 Contro(C), PEI(P), Chromicacid(CA), Chromicacid에  PEI처리(CAP), Chlorosulforic acid(CSA), Chlorosulforic acid 에 PEI처리(CSAP)한 6개의 종류로 각각 일정 수의 시편을 준비하여 담체에 고정화된 미생물의 건조무게를 측정하였다

2.2. 배지의 조성

본 실험에서는 각각의 여러 고분자 시편에서의 미생물의 고정화능력을 측정하기 위하여 미생물 건조 무게 측정법을 이용하였다. 인위적으로 만든 배양액에 담체를 넣고 일정기간동안 미생물과 함께 배양한후 꺼내어 담체 표면에 부착된 미생물의 양을 건조후 측정하는 방법을 따랐다. 미생물의 고정화 능력에 영향을 주는 요소로는 pH, 온도, 교반속도 및 교반조건, 기질(substrate)의 농도, 접종한 미생물의 농도(MLSS), Polycation(PEI)의 농도 등이 있다. 선택된 담체에 따른 각각의 고정화 능력에 영향을 주는 요소를 일정하게 유지한 상태에서 실험이 진행되었다.

배지의 조성은 1.1 g/l 함수포도당([eqn: rm C_6 H_12 O_6· H_2 O]),  0.1 g/l Ammonium chloride([eqn: rm NH_4 Cl]), 0.05 g/l Magnasium sulfate([eqn: rm MgSO_4· 7H_2 O]), 0.0005 g/l Ferrous sulfate ([eqn: rm Fe SO_4 · 7H_2 O]), 0.005 g/l Manganese sulfate([eqn: rm Mn SO_4 · H_2 O]), 0.00375 g/l Calcium chloride([eqn: rm CaCl_2]), 1 g/l Yeast extract, 18 ml 0.1M Phosphat-e buffer solution 이다. 이때 0.1M Phosphate buffer solution는 1M의 [eqn: rm K_2 HPO_4]와 [eqn: rm KH_2 PO_4]를 선택된 미생물의 성장조건에 따라 집어넣었다.  이때, 함수 포도당과 Yeast extract는 다른 성분들과 분리하여 Autoclave에서 멸균한다. 또한 배지 1□를 기준으로 했을 때 Magnasium sulfate ([eqn: rm MgSO_4· 7H_2 O]), Ferrous sulfate([eqn: rm Fe SO_4 · 7H_2 O]), Manganese sulfate ([eqn: rm Mn SO_4 · H_2 O]), Calcium chloride ([eqn: rm CaCl_2])은 미량이므로 Stock solution을 만들어 정확한 양이 배지에 포함되도록 하고, pH는 7.0으로 한다.

2.3. 담체의 고정화율 분석방법

배지액이 다 만들어 지면 화학적 에칭을 한 시편을 분석하기 위해 담체에 부착된 미생물의 양을 측정한다. 위의 배지 조성에 의해 1□를 기준으로 만든다. 멸균된 삼각 플라스크에 300 □의 배지를 취해 대상 미생물을 seeding 하고 shaker의 온도는 30℃, 교반 속도는 150회/min로 고정한다. 그 후, 24시간동안 플라스크에서 배양 한 다음 6개의 플라스크에 배양액을 100□씩 넣고 미생물 2000□를 취해 접종한다. 그 다음에 각 담체를 Methanol로 세척한 다음 약 64℃에서 건조 시킨 후 이를 각 플라스크에 넣고, 24시간 동안 shaker에서 미생물을 배양하면서 흡착 시킨다. 배양후 담체를 꺼내 일정량의 증류수로 세척한후 건조시킨다.  이때 미생물을 methanol로 세척하는 이유는 미생물 고정화 전에 담체에 붙어 있는 불순물 혹은 지용성 수용성 물질과 먼지가 담체 고유의 무게를 증가시키는 결과를 초래하여 미생물에 의한 무게 변화가 미묘한 Dry cell weight 법에서 오차의 요인이 될 수 있기 때문이다.  건조 무게를 측정하고 이를 담체의 단위표면적당 무게(g/m2)로 환산하였다.

2.4. 균의 특성

사용된 균은 영양원이 제한된 배지에서도 잘 자라지만 일반 영양원 배지에서도 잘 자라는 것으로 보아 Nitro, Nitrosomonas sp계열의 미생물은 아닌 것 같으나 암모니아와 아질산성 질소의 존재시 이들는 짙은 노란색으로 한천 배지에 고착되어 있는 정도가  같이 분리된 균주와 비교시 매우 강하며 일반적으로 동정된 균의 종은 대부분 암모니아 이용률이 높은 것으로 나타났다.

3. 결과 및 고찰

여러 가지 PE중에서 각각의 고정화된 미생물의 양을 Dry cell weight 측정법으로 분석해 본 결과 LDPE, LLDPE 의 흡착률이 큰 것으로 나타났다. 특히 LDPE에서 Chromic acid를 처리한 담체에서 LLDPE에 나타나지 않은 미생물 고정화 흡착량이 높게 나타난 것을 볼수가 있다. 또한 polycation 처리, Chromic acid 처리, Chlorosulfonic acid처리중에서 Chlorosulfonic acid 와 PEI를 병행하여 처리하는 방법이 다른 방법에 비해 보다 나은 흡착량을 보여준다.  정확한 data를 처리하기 위해서  Chlorosulfonic  acid 와 PEI 처리한 담체 시판을 가지고 반복 실험한 결과 거의 같은 결과를 보여주었다. 물론 미생물 흡착실험에 있어서 균일한 조건으로 실험이 진행된다는 것이 매우 어렵다. 일정량의 배양액에 미생물을 flask culture 하에 seeding 한다고 할지라도 정확히 같은 수의 미생물이라고 볼 수 없다. 하지만 이러한 실험변수상의 오차를 최대한 줄이기 위해 반복실험을 한 결과 일정한 개연성을 관찰할 수 있었다. 담체의 개발에 있어서 화학적 에칭에 의한 미생물 고정화율을 극대화시키는 방법 이외에 물리적으로 미세 기공을 만들어 표면적을 증가 시키는 가공 방법을 병행한다면 보다나은 미생물 고정화율을 얻을 수 있다고 본다.

참고문헌

1. Kolot, F. B., Process Biochemistry, Aug./Sept., 2, 1981.

2. M. Fletcher, in Microbial Adhesion to Surfaces, R. C. W. Berkeley, J. Melling . P. R. Rutter, and B. Vincent, Eds, Ch. 10, p. 197, 1980.

3. Bakke, R., Trulear, M.G., Robinson, J.A. and Characklis, W.G., Biotechnology and Bioengineering, 26, 1418, 1984.

4. Tampion, J. and Tampion, M. D., Immobilized Cells: Principles and Applications, Cambridge University Press,  Cambridge, 1987