재조합 bacteria를 이용한 방사선 유해성 탐지용 바이오 센서

민 지 호·이 창 우*·Robert A. LaRossa**·구 만 복

광주과학기술원 환경공학과

*한국원자력연구소

**Central Research and Development, DuPont Company, USA

Biosensor for on the toxicity detection caused by gamma-ray using recombinant bacteria

Jiho Min·Chang Woo Lee*·Robert A. LaRossa**·Man Bock Gu

Dept. of Environ. Sci. & Eng., Kjist, Kwangju, Korea

*Korea atomic energy research institute, Daejeon, Korea

**Central Research and Development, DuPont Company, USA

서 론

현재 가장 각광받고 있는 에너지인 원자력은 생물체에 유해한 방사선을 방출하기 때문에 문제시 되고 있다.  따라서 발전소나 연구소, 병원등에서 사용된 방사성 폐기물은 완벽한 처리 과정을 통해 방사선의 무해 여부를 확인하여 방출되게 된다.  이처럼 방사성 폐기물의 처리 과정이 복잡하고 철저하게 조절되는 이유는 방사성 폐기물의 생체내의 유저자를 변형시키기 떄문이다.  이들 방사선 중 특히 □-ray는 파장이 짧은 전자파 형태로 연속적인 이온화를 일으켜 DNA를 구성하는 pyrimidine과 purine에 oxidative damage를 일으켜 DNA double strand를 파괴한다(1).  세포내에서 DNA 손상 부위가 회복되지 못하면 cell division cycle이 G1기에서 멈취버리고 결국에는 세포사멸(apotosis)에 이르게 된다(2).

이처럼 유해한 방사선을 측정하기 위한 기기들이 계속해서 개발되었고, 그 성능 또한 정밀하고 정확하게 향상되어져 왔다.  그러나 기기들을 이용한 분석은 측정된 방사선량이 생체내에 어느 정도 피해를 주는 지에 대한 직접적인 판단은 불가능하다.  따라서 방사선에 대한 유해성 정도를 직접적으로 판단하기 위한 생물학적 센서의 개발이 필요하다고 하겠다.

이 론

최근 독성물질을 탐지하기 위한 bioassay는 주로 성장 속도가 빠르고 반응 정도가 민감한 박테리아를 이용하고 있다.  박테리아는 성장 중에 발생하는 단백질 손상, DNA  손상, membrane 손상 등의 stress를 특정한 반응 시스템을 이용하여 감소시키고 적응해 나가게 된다.  이중 특히 DNA 손상으로 인한 stress는 SOS 레귤론이라는 반응 시스템을 통해 감소시키게 된다 (3, 4).

박테리아가 UV나 □-ray와 같은 ionizing radiation에 의해 DNA 손상을 입게되면 SOS 반응에 의해 손상 부위가 회복되게 된다.  이들 SOS 반응은 주로 recA와 lexA 유전자의 생성물에 의해 조절되어 지게 되는데, 이중 recA promoter는 DNA 손상으로 인한 SOS 신호를 인식하여 억제제인 LexA 단백질을 분해하고 SOS 반응 관련 유전자들의 발현을 유도하게 된다.  따라서 DNA 손상시에 recA promoter의 turn on이 중요한 역할을 한다.  우리가 본 실험에서 이용한 재조합 박테리아는 recA promoter와 유전자 발현 정도를 쉽게 판단할 수 있는 lux 유전자가 융합되어 있어 DNA 손상이 발생하면 recA promoter가 lux 유전자를 발현시켜 bioluminescence가 발생하게 된다.  따라서 recA promoter를 가진 E. coli DPD2794는 DNA 손상을 야기하는 ionizing radiation으로 인한 DNA 손상를 민감하게 탐지해 방사선의 유해성 정도를 판단하는데 유용하게 이용되어 질 수 있을 것이다.

실 험 방 법

본 실험에서는 E. coli의 SOS 반응 promoter (recA)에 Vibrio fischeri의 lux system을 reporter gene으로 삽입시킨 plasmid를 함유하는 E. coli DPD2794를 사용하였다.  이 균주는 25□/□의 kanamycin (Sigma Co.)이 텀가된 Luria-Bertani (LB) 배지상에서 30℃, pH 7.0, 250rpm의 조건으로 shaking incubator에서 배양하였다.  100mL의 LB 배지에서 8시간 정도 자란 균주 2mL을 새로운 배지로 옮겨 1시간 정도 배양한후, 0.1mL씩을 test tube로 나누어 분주한후 □-ray를 조사받았다.  □-ray의 source는 60Co를 사용하였고, 방사선량별 조사시간과 거리를 다음의 공식을 기본으로 하여 계산하였다.

[eqn: D``=``h ``{S} over {d^2}]

(위의 공식에서 D는 전체 방사선량, h는 조사시간, S는 source의 에너지 세기, d 는 source에서 sample까지의 거리를 나타낸다.)

방사선 조사후 발생하는 bioluminescence를 측정하기 위한 luminometer는 Turner design의 TD-20e를 이용하였다.

결과 및 토론

저선량에서의 DPD2794의 반응 특이성

일반적으로 1 Gy 이하의 선량은 저선량으로 구분된다.  1 Gy 이하에서는 선량에 따라 빛의 양이 어느 정도 증가하는 경향은 나타나고 있지만 (결과는 나타내지 않음), 대조군과 비교하여 차이가 크지 않은 것으로 보아 이 정도 선량에서의 DNA 손상은 상당히 빨리 회복되는 것으로 생각된다.

고선량에서의 DPD2794의 반응 특이성

저선량에서는 눈에 띤 반응이 나타나지 않았지만,  3 Gy 이상의 선량에서는 상당히 sensitive한 반응이 나타났다.  Figure 1을 보면 200 Gy에서 28000 정도의 최대량의 빛이 방출되었고, □-ray 조사후 약 15 min이 지나면서부터 대조군과 비교하여 빛의 양이 차이가 나타나기 시작하므로, □-ray에 의한 유해성 정도를 상당히 빠르게 탐지할 수 있다는 것을 확인하였다.  또한 선량에 따라 발생하는 빛의 양이 dose-dependent response를 나타내어 200 Gy까지는 일정하게 증가하다가 200 Gy 이상의 선량에서는 다시 감소하는 양상을 나타내고 있다 (fig. 2).  또한 50 Gy 이하의 범위에서는 반응 정도가 상당히 linear한 형태로 나타나고 있어 생성되는 빛의 양을 가지고 역으로 선량 추정이 가능하리라 생각된다.

□-ray 조사후의 cell growth

고선량에서 세포 성장은 정상적으로 이루어 지는지를 확인하기 위해 1 Gy와 50 Gy에서 100mL flask 배양을 통해 생성되는 빛의 양과 OD600을 측정하였다.  결과는 fig. 3에 나타나 있다.  1 Gy 에서는 세포 성장 상태가 대조군과 유사하고 생성되는 빛의 양 역시 많은 차이를 나타내지 않는다.  그에 반해 50 Gy에서는 대조군과의 성장 정도 차이가 상당히 나타나고 생성되는 빛의 양 역시 20000에 달하고 있다.  따라서 고선량의 □-ray 조사후 선량에 따라 빛의 양 차이뿐만 아니라, 세포 성장도 차이가 난다고 할 수 있다.

이상의 결과에서도 알 수 있드시, DPD2794는 □-ray의 선량별로 dose-dependent response를 뚜렷하게 나타내었다.  또한 그 반응 정도가 매우 빠르고 민감하게 나타나고 있는 것이 확인되었다.  따라서 지금까지 수행한 실험 결과를 바탕으로 DPD2794를 이용하여 □-ray로 인한 생명체의 피해 정도와 안정성 정도를 규명한다면 현재 이용되고 있는 많은 방사선 분석 방법들 보다 훨씬 신속하고 간편하면서도 정량적인 분석까지도 가능하리라 생각된다.

참 고 문 헌

1. Thierry Douki, Thierry Delatour, and Jean Cadet. 1996. Measurement      of Oxidative Damage at Pyrimidine Bases in □-irradiated DNA. Chem.       Res. Toxicol. 9:1145-1151.

2. Steven P. Linke, Kristie C. Clarkin, Aldo Di Leonardo, and Geoffrey     M. Wahl. 1996. A reversible, p53-dependent G0/G1 cell cycle arrest           induced by ribonucleotide depletion in the absence of detectable DNA         damage. Genes & Development. 10:934-947.

3. Rupani S. P., Man Bock Gu, Konstantinov van Dyk, T. K. and           Robert A. LaRossa. 1996. Characterization of the stress response of a        biological sence of in batch and continuous cultures. Biotechnol. Prog.        12:387-392.

4. Amy C. Vollmer, Shimshon Belkin, Dana R. Smulski, Tina K. Van       Dyk, and Robert A. LaRossa. 1997. Detection of DNA damage by use of     Escherichia coli carrying recA::lux, uvrA::lux, or alkA::lux reporter           plasmids. Appl. Env. Microbiol. 63, 7:2566-2571.

Figure 1. 고선량에서의 DPD2794의

각 선량별로의 반응 특이성

(a)                                  (b)

Figure 2. DPD2794에서 선량별로 생성된 빛의 최대값 비교. (a) 조사받은 전체            선량에 따른 빛의 최대값 비교. (b) 50 Gy 이하의 선량부분을 확대.

(a)                                 (b)

Figure 3. 선량별 DPD2794의 (a) cell growth curve와

(b) 각각의 bioluminescence graph.