하얀곰팡이를 이용한 ligninase 동위효소의 생성과 클로로 페놀류의 분해연구.

최 수 형·이 화 영·문 승 현·구 만 복

광주과학기술원 환경공학과

A study on production of Ligninase isozymes and Biodegradation for Chlorinated Phenolics using White rot fungus

Sue Hyung Choi·Hwa Young Lee·Moon Seung-Hyeon·Man Bock Gu.

Dept. of Environ. Sci. & Eng., KJIST, Kwangju, Korea

서 론

하얀 곰팡이 Phanerochaete chrysosporium은 나무에 살고 있는 호기성 곰팡이로 영양분이 고갈되었을 때 cellulose를 에너지원으로 이용하기 위해 이들을 둘러싸고 있는 lignin을 분해한다. lignin을 분해하기 위해 곰팡이가 분비하는 물질로는 Lignin peroxidase, Manganese peroxidase, H2O2, Veratryl alcohol과 Oxalate를 포함하며 이들 lignin 분해체계를 이용하여 P. chrysosporium은 난분해성 물질인 lignin을 효율적으로 분해한다. P. chrysosporium에 의해 분비되는 lignin 분해관련효소들은 기질의 특이성이 매우 낮아 lignin과 유사한 구조를 갖는 다양한 고리화합물로 된 오염물질을 분해할 수 있으며(1,2,3) Mn-peroxidase와 lignin peroxidase는 높은 산화환원전위를 갖기 때문에 다른 peroxidase가 분해할 수 없는 기질을 이용할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 난분해성 화합물의 효율적 분해에 관여하는 lignin 분해효소를 생산하는 P. chrysosporium을 이용하여 최적 배양 및 분해조건을 연구하였다.

이 론

Phanerochaete chrysosporium에 의한 난분해성 물질의 분해반응 특성

Phanerochete chrysosporium은 많은 종류의 isozyme들(H1-H10)을 분비해 내는데 이들의 분자량은 38,000에서 46,000 사이이며, 매우 비슷한 단백질의 1차구조와 3차구조를 가지고 있다. 이들 효소들은 특이한 반응성을 가지고 있는데 다음과 같이 요약할 수 있다. 반응성이 없는 휴지기의 효소는 H2O2로 부터 전자 2개를 얻어서 compound I으로 산화된다. compound I은 한 개의 전자를 이용하여 기질을 산화시키고 compound II로 전환한다. compound II는 또 다른 기질을 산화시키고 휴지기의 상태로 돌아감으로써 반응회로를 형성하게 된다.(4)

ferric peroxidase  +  H2O2   □□□□→   compound I  +  H2O

(Resting Form)                   (2개의 전자가 산화된 상태)

compound I   +   A-(기질)   □□□□→   compound II   +   A

compound II   +   A-(기질)   □□□□→   ferric peroxidase   +   A

위의 반응회로는 과다한 H2O2에 의해서 방해를 받게 되는데  compound II가 기질이 없는 상태에서 H2O2와 만나게 되면 compound III를 형성하게 되는데, 이 과정을 거치면서 효소는 비가역적으로 불활성 된다

compound II   +   H2O2    □□□□→    compound III (불활성)

(기질이 없는 경우)

그 결과 반응회로에서 이탈하게 된다.

실험방법

Phanerochaete chrysosporium(ATCC24725)을 37℃ malt agar plate에서 일주일간 배양하여 spore를 형성한 후 멸균한 glass wool을 통과시켜 6 x 105 /mL가 되도록 접종하였다. 배지의 성분은 Tien and Kirk(Kirk et al., 1988)(5)을 따랐으며 이틀이 지난 후 0.4 mM veratryl alcohol과 0.05 % tween 80를 첨가하였다. lignin peroxidase 활성도는 veratryl alcohol의 산화능력으로 측정하였다. (Kirk et al., 1988)(5). 배양액중의 효소의 양상은 12 % SDS-PAGE gel elctrophorosis를 통하여 확인하였으며 오염물질의 분해정도는 HPLC로 분석하였다.

결과 및 토론

Polyurethane foam으로의 고정화

전단력에 약한 ligninase를 보호하기 위해서 Polyurethane foam에 고정화하여 배양하였을 경우 free pellet의 경우(LiP 30 unit/L)에 비해 8 배정도의 lignin peroxidase의 생산성 향상(LiP 250 U/L)을 가져왔다.(3)

배지조성에 따른 lignin peroxidase의 생산성 비교

일반적으로 lignin peroxiase는 질소원이 결핍된 상태에서 잘 생산되어지는데 본 연구에서는 질소원이 풍부한 경우에도 lignin peroxidase의 활성을 확인할 수 있었다.(그림 2) 또한 질소원이 풍부한 경우 lignin peroxidase의 활성이 떨어지기 시작하고 있는 9.5 일에 veratryl alcohol 0.4 mM을 첨가해 준 경우 다시 lignin peroxidase의 활성이 증가함을 확인하였다. 그러나 동위효소의 분포에 있어서는  두 조건 사이에 차이를 보였다. 그림 3에서 보는 바와 같이 SDS-PAGE 분석결과 질소원이 결핍된 상태에서는 Manganese peroxidase에 해당하는 H3, H4, H5(45,000)와 Lignin peroxidase에 해당하는 H7, H8(42,000)이 주로 생산되는 반면, 질소원이 풍부한 상태에서는 Lignin peroxidase에 해당하는 H1, H2(28,000)와 H6, H10(43,000)이 주로 생산되었다.

Isozyme 분포에 따른 오염물질의 분해

위의 조건에서 확인한 상이한 효소분포를 바탕으로 pentachlorophenol의 분해효율을 비교하였다. 그 결과 lignin peroxidase와 manganese peroxidase를 함유한

질소원이 결핍된 배양액을 이용하여 PCP를 분해한 경우가  Lignin peroxidase만을 함유한 질소원이 풍부한 배양액을 이용하였을 경우에 비해 높은 분해효율을 나타내었다(Data not shown). 이는 PCP를 분해하는데 있어서 lignin peroxidase가 단독으로 존재하는 것보다 Manganese peroxidase가 공존할 경우 더욱더 효율적인 분해가 이루어지기 때문인 것으로 보인다. 또한 질소제한 배지를 이용하여 클로로 페놀 류를 분해하였다. 반응용액으로는 lignin peroxidase 200 U/L를 함유한 배양액, 1.5 mM veratryl alcohol, 0.2 mM의 각각의 페놀류, 0.5 mM 과산화수소와 대조군으로서 효소를 포함하지 않은 배양액, 1.5 mM veratryl alcohol, 0.2 mM 의 페놀류, 0.5 mM 과산화수소를 이용하였다. 그 결과 그림 3에서와  2-chlorophenol과 2,4-chlorophenol, 2,4,5-chlorophenol에 있어서 가장 효율적인 분해를 보였다. 따라서 질소제한 배지에서 생산된 ligninase의 경우 2-chloro 작용기의 분해에 특히 효율적인 것으로 보인다. 또한 이들은 control에 있어서도 약간의 분해경향을 보였다. (그림 4(a))  경향성을 확인하는 또 다른 방법으로 0.2 mM 의 페놀류를 하나의 반응용액에 혼합한 후 분해경향을 비교하였다(그림 4(b)) 그 결과 각각의 분해결과에서 나타난 것과 마찬가지로 2-chloro기가 포함된 페놀류의 분해에 특히 효율적인 결과를 보였다. PCP는 초기에 분해되는 경향을 보이다가 나중에 다시 증가되는데 이는 반응용액상에 녹지않고 침전되었던 PCP(눈으로 확인 가능)가 다시 녹아들어 평형에 도달하기 때문인 것으로 보인다. 이들 혼합분해에서 특이한 점은 PCP를 제외한 다른 phenol의 경우 3시간 위치에서 농도가 다시 증가되는 경향을 보이는데 이는 각각의 분해(그림 4(a))에서 나타나지 않았던 현상으로 PCP, 2,4,5-chlorophenol, 2,4-chlorophenol, 2-chlorophenol, 4-chlorophenol, phenol순으로, phenol에 있어서 그 증가양상이 가장 잘 나타났다.  따라서 중간체의 축적으로 인한 증가로 생각되어진다.

(a) 각각의 페놀을 분해 후 비교

(b) 페놀류 혼합 후 분해

그림 4. 질소제한 배양액을 (LiP 200 U/L)을 이용한 클로로 페놀 류의 분해

참고문헌

1. 최수형, P. chrysosporium에 의한 lignin peroxidase의 생산과 PCP분해 연구, 광주과학기술원 환경공학과 석사학위논문(1996)

2. 최수형, 송은, 구만복, 문승현, P. chrysosporium에 의한 lignin peroxidase의 생산과 pentachlorophenol의 분해, 한국생물공학회지, Vol. 13, No. 3, 223-230,  1998

3. Sue Hyung Choi, E. Song, K. W. Lee, and S.-H. Moon,  M. B. Gu, Pentachlorophenol degradation using Lignin peroxidase Produced P. chrysosporium Immobilized in Polyurethane foam, Proceedings in The First international conferance on Remidiation of Chlorinated and Recalcitrant Compounds. May, 1998

4. Ortiz de Montellano, P. R. Control of the catalytic activity of prosthetic  heme by the structure of hemoproteins. Acc. Chem. Res. 20, 289-294, 1987.

5. Tien, M. and T. K. Kirk, Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium, Methods Enzymol., 161, 238-249, 1988