폐하수에서 분리된 미생물을 이용한 생물학적 폐하수 처리에 관한 연구

박철환, 최광근, 이종대*, 이진원

광운대학교 화학공학과, 한국생산기술연구원*

A Study on the Biological Wastewater Treatment

Using Microbes Isolated from Wastewater

Chulhwan Park, Kwangkeun Choi, Jongdae Lee*, Jinwon Lee

Department of Chemical Engineering, Kwangwoon University

Korea Institute of Industrial Technology*

서론

폐하수의 처리방법으로는 생물학적, 화학적, 물리적 방법이 있으나, 근래의 세계적 추세는 처리 단가가 비교적 낮으며, 2차 오염물의 발생이 적은 생물학적 처리, 또는 생물학적 처리와 화학적 처리를 병행하는 경향이 있다.  특정 화합물, 난분해성 물질, 중금속 등에 대한 분해미생물들의 연구는 국내외에서 활발히 진행되고 있는 실정이다.  Lecce 등은 자일렌(xylene) 분해 균주 Pseudomonas stutzeri를 분리했으며[1], Feng 등은 chlorinated-pyridinol 분해 균주 Pseudomonas sp. ATCC 700113을 토양으로부터 분리했다[2].  또, Wang 등은 카드뮴(cadmium)을 제거할 수 있는 균주를 심해로부터 분리했으며[3], 염색폐수 분해능을 지닌 여러 균주들의 연구도 많이 진행되고 있다[4,5].  이창호 등은 phenol 분해 균주인 Acinotobacter sp. GEM2를 분리했고[6], 이한기 등은 Zoogloea ramigera를 이용한 중금속 흡착에 관한 연구를 했으며[7], 오희목 등은 Naphthalene 분해 균주인 Alcaligenes sp. A111을 분리했다[8].

이처럼 여러 종류의 산업폐수와 특정 화합물에 대한 분해 균주의 개발은 활발하게 진행되고 있으나, 우리 나라의 폐하수 발생량 중 50%이상을 차지하고 있는 생활 폐하수 분해균주에 대한 연구개발은 미비한 실정이다.  균주 개발은 지난 수 십년간 발전을 거듭해 왔는데, 더 효율적으로 생활 폐하수 처리를 위한 우수 균주를 분리 및 선별하고, 각 균주의 분해능을 파악하여 보다 효율적으로 이들 미생물을 관리, 배양, 서식시키는 방법을 고안하여, 폐하수별 특성에 적합한 미생물 균주의 분리 및 선정과 미생물 배양 방법 확립 등이 필요한 실정이다.

본 연구에서는 경기도 구리시 장자연못으로부터 균주를 분리하고, 분리된 균주 중 생활 폐하수에 대해 분해능이 뛰어난 균주를 선별하였고, 균주의 특성을 규명하였으며, 최적 배양 조건을 확립함으로써 우수 균주를 확보하고자 하였다.  또한 분리된 미생물들의  산소 이용율(oxygen utilization rate, OUR)과 화학적 산소 요구량(chemical oxygen demand, COD) 제거율과의 관계, 중금속 및 독성물질이 미생물의 활성 변화에 미치는 영향에 대해서도 연구하였다.  연속 회분식 반응조를 이용하여 단일균주 및 복합균주를 이용한 폐하수의 COD 제거율을 조사하여, 보다 효율적인 처리조건을 파악하여 생활 폐하수 분해능이 우수한 균주를 개발하고자 하였다.

실험방법

1. 균주의 선별 및 동정

본 실험에 사용된 균주는 경기도 구리시의 장자연못에서 채집한 폐하수를 멸균된 증류수로 희석한 후 희석액을 고체상태의 완전배지에 도말하여 분리하였다.  분리된 우수 균주에 대한 균주의 동정은 Bergey's manual of determinative bacteriology[9]와 Manual for the identification of medical bacteria[10]에 따랐다.

2. 균주의 보관

균주의 보관은 0.5□의 80%의 살균된 glycerol과 0.5□의 최대 활성을 지니는 시점까지 배양시킨 배양액을 혼합해 -15℃에서 냉동 보관하였다.  또는 미생물이 번식하고 있는 위의 배지를 1억배로 희석한 1□를 LB 한천배지에 골고루 도말한 후 4℃에서 냉장 보관하였다.  실험을 할 때에는 살균한 루프(loop)를 사용해 저장된 미생물을 균체를 증식시킬 배지에 접종시켰다.

3. 배지조성 및 배양방법

균주의 분리와 보관을 위한 액체배지는 LB 배지를 사용하였으며, tryptone 10g, NaCl 5g, yeast extract 5g, 증류수 1L의 조성을 지닌 LB 배지는 121℃, 1.5기압으로 20분간 살균한 후 사용하였다.  고체배지에서는 agar(1.5%, w/w)를 첨가하였다.  균주의 예비배양은 250□와 500□ 진탕배양용 삼각플라스크를 사용하여 30℃, 150rpm의 조건으로 저온배양기(Shaking Incubator SI-900R, Jeio Tech Co. Korea)에서 진탕배양하였고, 균주의 특성 실험에서는 5L 작업용량의 발효기(KF-Series 5L, 한국발효기, Korea)를 이용하였다.

4. 선별균의 pH, 온도에 대한 균체증식 영향 실험

배양시간에 따른 균체증식, pH에 따른 균체증식, 온도에 따른 균체증식 등에 관하여 조사하였다.  pH에 따른 균체증식의 영향은 각 단계별로 pH 3∼pH 11사이에서 배양하여 균체증식을 측정하였다.  온도에 따른 균체증식의 영향은 각 단계별로 10℃∼45℃사이에서 배양하여 균체증식을 측정하였다.  균체증식의 측정은 UV Spectrophotometer(CECIL 3000 series, England)를 사용했으며, 파장 600nm에서 OD값을 측정해 구하였다.

5. COD 제거율과 OUR 측정

COD의 측정은 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater에 따라 측정했으며[11], COD의 제거율은 처리전과 처리후의 COD를 측정함으로써 계산하였고, 미생물의 생물학적 활성도를 측정하기 위한 OUR의 측정은 O2 Sensor(METTER TOLEDO sterilizable O2 sensors, Switzerland)를 이용하였다.

6. 폐하수 처리를 위한 실험 및 저해물질에 대한 미생물 활성도 영향 실험

경기도 구리시 장자연못의 폐하수를 이용하여 실험하였다.  폐하수 처리 실험은 연속 회분식 반응조을 이용하였고, 폐하수내의 혼합균주를 이용한 COD 제거율, 분리된 각 단일균주의 COD 제거율, 분리된 단일균주 접종시의 COD 제거율, OUR 측정, OD 측정, 균주의 중금속 및 독성물질에 대한 영향을 조사하였다.

결과 및 고찰

1. 분리균주의 특성 및 동정

본 실험에서 분리된 균주들은 45분∼80분사이의 배가시간(doubling time, td)을 나타내었고, 분리된 균주들 중 COD 제거율이 우수한 2가지 균주를 선별하고,  이를 이용한 폐하수 처리 실험을 하였다.  폐하수 처리 실험을 통하여 COD 제거율이 우수한 균주로 밝혀진 2가지 균주를 각각 BLP2052와 BLP20515로 명명하였고, 배가시간은 각각 46.2분, 49.5분이었다.  36시간 연속 회분식 반응조 운전 후의 단일균주 BLP2052와 BLP20515의 COD 제거율은 각각 54.2%, 53.9%였고, 84시간 운전 후의 COD 제거율은 각각 66.0%, 65.7%였다.  생물학적 폐하수 처리에 있어서 생할 폐하수의 COD를 효율적으로 분해시킬 수 있는 균주임을 확인하였다.  분리균주 BLP2052는 Gram 음성균으로써 약간의 운동성을 가지며, 호기성 세균이며, 기본배지의 초기 pH와 배양온도가 생육에 미치는 영향을 조사하였다.  초기 pH 3.0∼11.0사이에서 변화를 주어 배양한 결과, 초기 pH 6.0∼8.0에서 생육은 왕성하였으나, 그 이외의 pH에서는 생육이 급격히 저하하는 결과로 생육이 안정한 pH영역이 좁음을 알 수 있었다.  10℃∼45℃범위에서 배양한 결과 20℃∼37℃에서 생육이 잘 됨을 알 수 있었다.  최적 pH는 7.0, 최적 온도는 30℃였으며, Bergey's manual of determinative bacteriology와 Manual for the identification of medical bacteria에 따라 형태적, 생화학적 특성을 파악하고 동정한 결과 Pseudomonas sp.였고, Pseudomonas sp. BLP2052로 명명하였다.

분리균주 BLP20515은 Gram 음성균으로써 운동성은 없었으며, BLP2052에서와 동일한 조건에서 pH와 배양온도에 대한 영향을 조사하였다.  초기 pH 6.0∼8.0에서 생육은 왕성하였고, 그 이외의 pH에서는 급격히 생육이 저하하는 결과로 생육이 안정한 pH영역이 좁음을 알 수 있었으며, 20℃∼37℃범위에서 생육이 잘 됨을 알 수 있었다.  초기 pH와 배양온도에 대한 영향은 Pseudomonas sp. BLP2052와 유사한 경향을 보였고, 최적 pH는 7.0, 최적 온도는 30℃였다.  BLP20515는 BLP2052와 동일한 방법으로 동정한 결과 Flavobacterium sp.였고 Flavobacterium sp. BLP20515로 명명하였다.

2. 분리 균주와 폐하수내 혼합균주를 이용한 폐하수 처리에서의 미생물 활성도

분리된 균주 Pseudomonas sp. BLP2052와 Flavobacterium sp. BLP20515를 이용해 멸균시킨 폐하수의 COD 제거율과 OUR과의 관계를 그림 1과 그림 2에 나타내었다.  두 균주 모두 초기에는 폐하수 적응 단계로써 산소 소비율이 낮았으나, 12시간 후에 OUR은 최대를 나타내었고, 점차적으로 OUR이 감소하는 경향을 보였다.  폐하수내의 혼합균주를 이용하여 연속 회분식 반응조로 처리를 한 경우는 COD 감소율과 OUR은 동일한 경향을 나타내었으며, 그 결과는 그림 3에 나타내었다.

3. 분리균주와 복합균주의 COD 제거율과 저해물질에 대한 미생물 활성도

멸균된 폐하수에 Pseudomonas sp. BLP2052 균주만을 접종한 경우, 멸균된 폐하수에 Flavobacterium sp. BLP20515 균주만을 접종한 경우, 폐하수내의 복합균주를 이용한 경우, 폐하수내에 분리된 균주 Pseudomonas sp. BLP2052와 Flavobacterium sp. BLP20515를 각각 접종하여 84시간 동안 생물학적 처리를 한 결과 COD 제거율은 각각 66.0%, 65.7%, 80.0%, 85.6%, 84.1%를 나타내었다.

저해물질에 대한 미생물 활성도 실험에서는 저해물질 농도 0ppm∼600ppm범위에서 1시간 동안에 미생물이 저해물질에 의해 받는 활성도 감소를 조사하였다.  각각의 저해물질에 대해 50ppm∼100ppm사이에서 미생물 활성이 급격히 감소하였고, 그 이상에서는 점차로 감소해 500ppm이상에서는 미생물의 활성이 정지상태에 있음을 확인하였으며, 그 결과는 그림 4에 나타내었다.

참고문헌

1. C. D. Lecce, M. Accarino, F. Bolognese, E. Galli, and P. Barbieri, Appl. Environ. Microbiol., 63,8,3279-3281 (1997)

2. Y. Feng, K. D. Racke, and J. Bollag, Appl. Environ. Microbiol., 63,10,4096-4098 (1997)

3. C. L. Wang, P. C. Michels, S. C. Dawson, S. Kitisakkul, J. A. Baross, J. D. Keasling and D. S. Clark, Appl. Environ. Microbiol., 63,10,4075-4078 (1997)

4. X. Li, and P. Gao, Lett. Appl. Microbiol. 22,209-213 (1996)

5. 김만구, 류원률, 조무환, Korean J. Biotechnol. Bioeng. 12,1,1-7 (1997)

6. 이창호, 오희목, 권태종, 권기석, 김성빈, 고영희, 윤병대, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 22,6,692-699 (1994)

7. 이한기, 배우철, 진욱, 정욱진, 이삼빈, 정병철, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26,1,83-88 (1998)

8. 오희목, 강정현, 이창호, 박찬선, 안성구, 윤병대, 고영희 등, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 22,4,423-429 (1994)

9. G. H. John, R. K. Noel, H. A. S. Peter, T. S. James, T. W. Stanley, "Bergy's Mannual of Determinative Bacteriology", 9th ed. Williams & Wilkins, Baltimore. (1994)

10. N. R. Cowan and K. J. Steel, "Manual for identification of medical bacteria". 2nd ed. Cambridge University Press, London. (1974)

11. APHA, "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", 19th ed., Washington, DC. (1995)

그림 1. 멸균한 폐하수에 Pseudomonas sp. 접종시         그림 2. 멸균한 폐하수에 Flavobacterium sp. 접종시

그림 3. SBR을 이용한 생물학적 폐하수 처리           그림 4. 저해물질 첨가시 1시간 동안의 미생물의 활성변화