Pullulan 생합성에 대한 통기와 교반의 영향

양승남, 백승우*, 김남기

성균관대학교 화학공학과, 두산기술원*

Effcet of Aeration Rate and Agitation on Pullulan Fermentation

Seung Nam Yang, Seung Woo Baek, Nam Ki Kim

Department of Chemical Engineering, SungKyunKwan university

Doosan Technology Center*

서론

Pullulan은 불완전곰팡이의 일종으로서 일반적으로 혹효모라고 알려진 Aureobasidium pullulans에 의해서 생성되고 체외로 분비되는 생분해성 천연다당류의 한 종류로 Maltotriose의 고분자로 형성되어 있다. pullulan 의 생합성 경로는 아직 잘 알려져 있지 않아, A. pullulans에 의한 pullulan생산 연구는 배양 생리학적 측면에서 연구되고 있다.

A. pullulans는 단당류, 이당류, 전분 등 비교적 다양한 탄소원에서 잘 성장할 수 있으며, 특히 sucrose, soluble starch, 기타 전분 가수분해물에서 pullulan 생산수율이 높다고 보도되고 있지만, 실험에 사용되는 균주에 따라 그 수율이 달라지기도 한다.(1,2)

Pullulan은 다른 어떤 다당류보다도 물에대한 용해성이 뛰어나 tea bag이나 photosensitive resin등과 같이 수용성 포장이나 coating 재료로 널리 사용될 수 있는 독특한 성질을 가지고 있다. pullulan은 인체에 독성이 전혀 없으며 인체에 흡수되면 소화기관에서 분해가 거의 일어나지 않아 저칼로리 식품첨가제로서 사용될 수 있다. pullulan은 화학적으로 합성된 고분자와는 달리 Aerobacter aero-

genes가 분비하는 pullulanase나 Aspergillus niger가 분비하는 isopullulanase에 의해서 쉽게 분해되므로 환경오염의 문제가 없다.(3) 이런 다양한 물성에 의해서 식품, 필름, 포장, 전자, 의료, 사진, 인쇄등의 재료로 그 적용범위가 넓으며 앞으로도 그 용도가 계속 개발 및 개선 됨에 따라 시장이 증가하는 추세에 있다.       Pullulan 발효는 호기성 발효로 교반속도나 배지의 pH, 질소원과 탄소원의 상대적 농도, O2 전달 등과 같은 배양 조건에 따라 세포량과 pullulan 생산이 증가한다. pullulan은 생성된 다당류에 의하여 생물반응기내의 점도가 높아져 교반이 곤란해지고, 용존산소의 공급이 감소되어 pullulan 생산이 떨어지게 되는데, 이 문제는, 산소 유용도(oxygen availability)를 증가시킴으로서 해소하고자 한다. 따라서 pullulan 생산성을 증가시키기 위해 산소전달과 교반속도와의 관계를 구명하고자 aeration rate와 교반속도를 변화시키면서 pullulan 생합성의 최적 조건을 찾는데 본 연구의 목적이 있다.

재료 및 방법

사용균주

본 연구에서 pullulan 생합성을 위해 사용한  Aureobasidium pullulans 균주는 한국종균협회에서 분양받았다.

배지 및 배양조건

A. pullulans는 AYS 한천배지(pH7.5)에 접종하여 25℃에서 3일 배양하여 실험에 사용하였으며 AYS 배지조성은 sucrose 5%, K2HPO4 0.5%, NaCl 0.1%, MgSO4·7H2O 0.02%, (NH4)2SO4 0.06%, yeast extract 0.1% (w/v)였고, 본 배양은 5L 발효기 (KFC)에 3L의 배양액을 넣어 수행하였다. 접종량은 10%(v/v)을 기본으로 5와 10으로 변화시켜 보았고, 공기 공급량은 1 vvm을 기본으로 0.5∼1.5까지 변화를 주었으며, pH는 외부에서 조절하지 않았으며, 교반속도는 500 rpm을 기본으로 500과 900으로 변화를 주었다.

건조 균체량과 pullulan 정량

균체량 측정은 배양액 10mL을 8,000 rpm에서 20분 원심분리 하였으며, 점도가 높아 균체분리가 어려운 경우 배양액을 증류수로 2배 희석한 다음 원심분리하였다. 침전된 균체를 증류수 10mL에 현탁하여 1회 세척한 다음 70℃에서 15시간 정도 건조시켜 건조무게를 측정하였다. 균체량은 배양액 1 리터당 건조무게로 표시하였다. pullulan 농도는 균체가 제거된 배양액에 2배 부피의 에탄올을 첨가한 후 냉동실에 30분 정도 방치하여 다당류를 침전시킨 다음 6,500 rpm에서 원심분리시켰고 침전된 다당류를 남겨두고 위의 상등액은 버린다. pullulan의 세척을 위해서 다시 에탄올을 가하고 원심분리 시킨다. 원심분리후에 알코올은 버리고 70℃에서 15시간 건조시킨 후 무게를 측정하였다.

당분석

잔여 sucrose 농도는 배양액을 원심분리한 상등액에서 채취한 시료 1 ml을 HPLC( Waters 510 )를 사용하여 정량하였다. HPLC에 의한 당분석 조건은 Table. 1(4) 에 나타내었다.

Table 1. HPLC conditions for sugar analysis

Column		Sugar-pakⅠ □ 6.5mm×300mm
Sample amount		10 □l
Detection		RI
Flow rate		0.5 ml/min
Mobil phase		0.0001M Ca-EDTA
Sample preparation		Centrifugation(8,000rpm, 20min)
Temperature	internal	40℃
	external	90℃

결과 및 토론

Fig. 1 은 aeration rate에 대한 미생물의 변화를 나타낸 것으로, 처음 하루까지는 비교적 낮은 성장속도를 보이지만 하루가 지난 후부터는 균체의 성장이 계속되며 그 양이 증가함을 알 수 있었다. 특히 공급되는 aeration rate가 클수록 성장이 더 활발하였으며 배양시간 72 시간, 1.0 vvm에서 19.44 g/L의 최대 성장을 보였다. Fig. 2 역시 aeration rate가 클수록 미생물의 성장이 증가함을 볼 수 있었고 배양시간 48 시간만에 12.73 g/L 의 최대 성장을 보였다. 그러나, 500 rpm에 비해서는 다소 낮은 성장을 보임을 알 수 있었다. 결국 교반속도가 클수록 미생물의 성장은 빨라졌지만, 빠른 shear rate 또는 stress에 기인한 미생물 균체의 사멸로 인하여 더 이상의 성장은 볼 수 없었다.

Fig. 3 은 aeration rate에 대한 pullulan의 양을 나타낸 것으로, 500rpm에서는

aeration rate가 클수록 생성되는 pullulan의 양이 증가함을 볼 수 있었고,1.5vvm 에서 최대 64.8 g/L 의 생성을 볼 수 있었다. 이것을 Fig. 4의 900 rpm과 비교해 보면 거의 두배에 가까운 생산량의 증가를 보임을 알 수 있다. 이것들에 대한 결과를 다음의 Table. 2에 나타내었다. 이 상의 결과에서 보듯이 pullulan 생성의 최적조건은 500rpm에서, aeration rate가 클수록 좋음을 알 수 있었다.

Table 2. Comparison of dry cell weight and pullulan

in various aeration rate and agitation

rpm	500 rpm			900 rpm
vvm	0.5	1.0	1.5	0.5	1.0	1.5
Xmax (g/L)	5.32	19.44	19.36	8.94	8.9	12.73
Pmax (g/L)	34.57	48.67	64.8	37.13	35.73	41.4

참고문헌

1. Bender, H. and K. Wallenfels. Biochem. Z. 334: 79-95(1961).

2. Wiley, B.J., D.H. Ball, S.M. Arcidiacono, S. Sousa, J.M. Mayer, and            D.L.Kaplan. J.Environ.Poly.Deg. 1: 3-9(1993).

3. 신용철, “Aureobasidium pullulans에 의한 세포외 다당류 pullulan의 생산에      관한 연구”, KAIST 박사학위논문. 9-11(1988).

4. Application 254, HPLC Applications, Macherey-Nagel(1993).