Alcaligenes xylosoxidans의 glucose 및 benzoate metabolism에 관한  연구

윤성윤, 이상훈, 이창용, 박철환, 이진원

광운대학교 화학공학과

A study on the glucose and benzoate metabolism of Alcaligenes xylosoxidans

Seongyun Yun, Sanghoon Lee, Changyong Lee, Chulhwan Park, Jinwon Lee

Department of Chemical Engineering, Kwangwoon University

서론

많은 종의 유기체가 대사의 산물로서 많은 종류의 유기물을 생산한다. 미생물의 대사에 있어서의 차이는 한편으로는 유기체의 유전적인 차이에서, 또 다른 한편으로는 자연환경으로부터 기인한다.  같은 종이라도 영양상태나 환경조건에 따라 다른 산물을 생산할 수 있다.  영양이나 환경적인 조절에 의한 대사경로의 조절은 생물공정공학에서 주요 관심사가 되어왔다.  그 예로 Saccharomyces cerevisiae(효모)는 혐기성 상태에서 배양될 때 에탄올을 생산한다.  그러나, 호기성 상태에서 길러질 때 주요 생성물은 효모이다.  게다가, 호기성 상태에서 포도당 농도가 높을 때는 약간의 에탄올 생성이 관찰된다.  이것은 효모의 대사조절이 산소뿐만 아니라 포도당에 의해서도 가능함을 나타낸다.

Alcaligenes xylosoxidans는 방향족 화합물을 포함한 배지에서 중간 생성물로 catechol을 생성하는데, 이것은 벤젠 고리가 붙어있는 물질들 특히 벤젠, 톨루엔, 자일렌을 잘 분해한다.  이러한 물질들을 분해할 때 벤젠고리의 ortho와 meta쪽을 선택하여 분해를 한다.  여기엔 작용하는 효소의 종류에 따라 생성물이 달라진다.  두 효소 중 pyrocatidase (catechol 1,2-dioxygenase)는 ortho방향을 선택하여 분해하고 metapyrocatedase (catechol 2,3-dioxygenase)는 meta방향을 선택하여 분해한다.  이 효소들은 방향족 화합물이 유도제가 되는 것으로 추측된다.  본 연구에서는 위 효소의 유도 조건과 내부 분해 메카니즘의 대사방향을 밝히고자 한다.

이론

대사는 이화(catabolism)와 동화(anabolism)의 두 가지 개념이 있다.  이화는 성분을 더 작거나 단순한 산물로 분해(예, 포도당의 이산화탄소와 물로 분해)시키는 세포내 공정이고, 동화는 더 복잡한 성분으로의 합성(예, 포도당을 글리코겐으로 합성)을 의미하고 이것은 에너지를 필요로한다.  본 연구에서 언급되는 대표적인 이화 대사는 다음과 같다.

포도당 대사: Glycolysis와 TCA회로

포도당은 많은 유기체의 주요 탄소원이자 에너지원이다.  어떤 유기체에는 포도당 동화때 몇몇의 다른 대사경로를 이용한다.  glycolysis 또는 Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) 경로는 많은 유기체에서 주경로이다.

포도당과같은 유기물의 호기성 대사는 세가지의 다른 단계로 이루어져 있다.

1. EMP대사는 포도당을 pyruvic acid으로

2. Krebs, tricarboxylic acid (TCA) 회로는 pyruvic acid을 CO2와 NACH로

3. 호흡(전자 전달 사슬)은 ATP의 생성을 위해 NADH에서 전자 수용체로 전       자를 이동시킨다.

Sodium benzoate 대사

Sodium benzoate는 자연환경에서 오염물질이지만 Alcaligenes xylosoxidans는 이 물질을 탄소원과 에너지원으로 사용할 수 있다.  Sodium benzoate에서 catechol이 생성되는 과정을 살펴보면,

NADH+H+  ♩    ↖  NAD+                                   NAD+ ♩     ↖ NADH+H+

benzoate    -->    dihydrodihydroxy-benzoate    -->    catechol   -->

O2   ↖                                                                  ♩ CO2

그리고 여기서 생성된 catechol은 ortho 경로를 따라서는 pyrocatechase에 의해 cis,cis-muconate를 생성하고, meta 경로를 따라서는 metapyrocatechase에 의해 2-hydroxymuconic semialdehyde를 생성한다.  만약, 과산화수소가 저해제로 사용될 경우 cis,cis-muconate만 생성된다.

위와같은 대사 network으로부터 부산물(by-product) 분석과 효소측정을 통해 Alcaligenes xylosoxidans의 대사 과정을 일부 밝힐 수 있다.

실험재료 및 방법

본 실험에서는 포도당 배지와 sodium benzoate 배지 두 가지 경우에 대해서 실험을 하였다.  포도당 배지의 조성은 다음과 같다.  glucose 10g/l, yeast extract 5g/l, (NH4)2SO4 5g/l, K2HPO4 11.2g/l, KH2PO4 4.8g/l, MgSO4·7H2O 1g/l, FeSO4·7H2O 0.001g/l 이다.  Sodium benzoate 배지는 sodium benzoate 1g/l, K2HPO4 5g/l, KH2PO4 4.5g/l, (NH4)2SO4 2g/l, MgSO4·7H2O 0.3g/l 이다.  Agar plate에 사용될 agar의 조성은 앞에 말한 조성에 전체 질량의 2%정도를 넣어서 사용하였다.

실험에 사용된 균주는 토양에서 분리된 Acaligenes xylosoxydans이다.  이것을 포도당 배지에서 호기적으로 배양하여 매 30분 마다 sample을 취하였다.  여기서 취한 sample 3□를 큐벳에 넣고 UV 590nm로 측정한 것이 그림 1에 나와있다.  그리고 이 sample의 부유물을 부산물 측정에 이용하였다.  부산물의 측정방법은 HPLC (High Performance Liquid Chromatograph)를 이용하였다.  여기에 사용된 column은 SUPELCOGEL C-610H Columns을 이용하였고, mobile phase는 0.1% 인산, 유속은 0.5□/min, 검출 파장은 UV 210nm, 내부 온도는 30℃ 그리고 10□를 주입하였다.

그리고 각 세포가 배출하는 부산물의 양을 측정하기 위하여 세포의 수를 측정하였다.  방법은 OD가 0.801, 1.152, 1.630일 때 취하여 1천만-1, 1억-1, 10억-1로 희석한 후 희석용액의 1□를 agar plate에 골고루 입히고 하루정도 배양을 하였다.

결과 및 토의

호기성 포도당 배지에서 Alcaligenes xylosoxidans의 성장속도

이 균주의 성장속도는 공기를 뿜어주는 batch culture에서 측정하였다.  그림 1은 이 균주의 성장 곡선을 나타낸다.  Lag phase, exponential phase, stationary phase를 갖는 전형적인 S자형 곡선을 얻었다.  Doubling time은 exponential phase에서 구하였는데, doubling time은 약 30분 정도가 나왔다.

부산물의 검출결과

HPLC로 검출하면 peak가 면적으로 나오게 되는데 농도로 환산을 하기위해 여러 종류의 standard sample을 준비하였다.  Standard sample은 기준 농도를 0.001mmol로 하여 HPLC에 10□를 주입하여 검출 시간과 면적을 구한다.  그리고 배지에서 취한 sample을 HPLC에 10□를 주입하여 얻은 검출 시간을 standard sample의 검출 시간을 비교한 후 농도를 계산한다.  그림 2와 3은 HPLC로 검출한 것인데, lactic acid, □-glutarate 모두 유기산으로 농도증가를 가져왔다.

OD에 따른 세포의 수

세포의 수는 성장 곡선의 세 OD의 값에서, 이 것을 희석을 시킨 후 agar plate에 배양을 하였는데 plate에서 자란 세포의 점을 센다.  그리고 희석 배율만큼 곱하여 얻은 값은 1.69×1011, 9.3×1011, 1.8×1012이다.  이것은 1□에 있는 세포의 갯수를 나타낸다.  그림 4는 세포의 증가가 OD의 증가에 선형적으로 증가함을 나타낸다.

위의 부산물 이외에도 다수의 미지 부산물이 검출되어 현재 확인 과정에 있으며, 효소 측정을 통해 효소의 유도조건을 탐구하고 있다.