Chitosan에 의한 미생물 균체 성분 변화 및 항균활성.

박석규*·이상원**·문일식

순천대학교 화학공학과, 순천대학교 식품영양학과*,

진주산업대학교 미생물공학과**

Changes in Whole Cell Composition and Antimicrobial

Activity of Microorganisms Treated by Chitosan

Seok Kyu Park*, Sang Won Lee**, Il Shik Moon

Dept. of Chemical Engineering, Sunchon National

University, Sunchon 540-742, Korea

*Dept. of Food and Nutrition,Sunchon National

University, Sunchon 540-742, Korea

**Dept. of Microbiological Engineering, Chinju National

University, Chinju 660-758, Korea

서론

최근Chitosan은 항균성을 갖고 있는 것이 알려지면서 식품의 보존성 증진제로서의 이용이 확대 되고 있다. Chitosan의 항균작용은 대체로 미생물 세포 표층부에 작용하여 물질의 투과성 및 대사에 영향을 주는 것으로 추측되어진다. 이와같은 chitosan은 원재료인 갑각류의 보관상태, 분리원의 종류나 특성에 따라서도 다르고, chitin으로부터 만들어지는 Chitosan의 이화학적 특성(점도, 분자량, 탈아세틸화도)에 따라서도 항균활성 및 항균spectrum이 약간씩 달라질 것으로 생각된다.

따라서 본 연구에서는 게껍질중의 chitin을 천연항균제로서 활용하기 위하여 몇가지 물성이 다른 chitosan을 제조하여 각각에 대한 항균 특성을 조사하였다.

실험재료

Chitosan의 제조는 게껍질을 95% 아세톤으로 실온에서 2-3회 처리하였으며, 그 다음 0.5N-HCl로 1시간동안 탈회 처리시키고, 100℃의 1N-NaOH로 12시간동안 탈단백질 처리를 2회 실시하였다. 탈아세칠화반응은 소정농도의 NaOH용액 일정량을 반응기에 넣고 소정량의 시료를 주입하여 반응시켰다. 냉각시켜 세척·건조한 다음, 탈아세칠화도를 측정하여 chitosan재료를 조제하였다.

공시균주는 B. subtilis, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, S. typhimurium를 사용하였으며, 배지는 LB(tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%)를 사용하였다.

항균활성 측정

최소 저지농도(MIC)는 L-type test tube에 멸균된 LB배지 4.8□(casamino acid를 사용), 각 농도별의 chitosan액 100□와 전배양액 100□를 가하여 진탕배양(100rpm, 30℃, 20시간)한 다음, 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 최소저지투여량(MID)은 chitosan을 0.5% acetic acid에 용해하여 disk에 spot한 다음, 용매를 휘발시켜 중층시험용 plate에 놓고, 배양(30℃, 24시간)하여 clear zone을 측정하였다. Chitosan의 항균활성에 대한 열안정성은 60℃(1시간), 80℃(1시간), 100℃(10, 20, 30, 50분), 121℃(10, 20, 30분)에서 열처리하여 그 액을 액체배양법에 의한 잔존 항균활성을 측정하여 열안정성을 조사하였다.

균체중의 지방산 및 아미노산 조성

Chitosan으로 처리된 균체중의 지방산은 균주를 배양하여 집균된 균체를 BF3-methanol로 methylester화시켜 GC로 분석하였다. 아미노산은 균체를 6N-HCl로 110℃, 24시간동안 가수분해시킨 후, 여과·농축하여 Na-citrate buffer(pH 2.2)로 정용하여 HPLC로 분석하였다.

결과 및 토론

Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Micrococcus 속의 대부분 세균이 300-350ppm에서 완전히 생육이 억제되었는데, 비교적 폭넓은 항균spectrum을 나타내었다(Table. 1). Chitosan의 분자량과 항균력에는 상관성이 있었고, 분자량이 적고, 탈아세칠화도가 높은 것이 항균력이 있는 것으로 나타났다. 최소저지투여량은 대부분 세균에서 800-1000□/disk범위였다.

Chitosan의 처리에 따른 균체 지방산 조성에서(Table 3), Escherichia coli는 palmitic acid(16:0)의 함량이 증가하는 반면 불포화지방산인 palmitoleic acid(16:1)의 함량이 감소하는 경향을 나타내었다. myristic acid(14:0)는 감소의 차이가 적었다. Chitosan의 처리에 따른 균체 아미노산 조성에서(Table 4), Escherichia coli는 chitosan처리함에 따라 증가를 보이는 아미노산은 proline, glycine, histidine 등이었다. Chitosan의 열안정성은 100℃까지는 상당히 안정하였으나 그 이상에서는 활성이 약간 감소하였다(Table 5).

Table 1. Minimum inhibitory concentration of chitosan

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Gram positive          Gram negative

CPS     DAC    □□□□□□□□□□□□□□□  □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□

B.      Sta.      E.      P.      Sal.

subtilis   aureus   coli aeruginosa typhimurium

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2.75   88.10     350      300      500     350      400

5.7    86.39     400      350      550     400      500

6.3    83.98     450      400      600     450      500

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CPS(unit of viscosity), DAC(diacetylation)

Table 2. Minimum inhibitory dose of chitosan(CP 2.75)

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Growth of microorganisms

Strains                   at varius chitosan dose

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CONT  200  400  600  800  1000  1200  1400

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B. subtilis        +    +    +    +    +     -     -     -

Sta. aureus        +    +    +    +    -     -     -     -

E. coli            +    +    +    +    +     +     -     -

P. aeruginosa      +    +    +    +    +     -     -     -

S. typhimurium     +    +    +    +    +     +     -     -

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Table 3. Fatty acid composition of E. coli treated with chitosan

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Added amount           Fatty acid compositiom(area %)

(ppm)     □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□

14:0   16:0   16:1   17:0   18:0   18:1   others

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0          1.72   27.32  20.65  1.43   2.03   32.58   14.27

400         1.63   28.76  19.47  1.32   2.16   32.67   13.99

800         1.54   29.18  17.32  1.19   2.23   33.71   14.83

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Table 4. Amino acid composition of E. coli treated with chitosan

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Amino                          Added amount(ppm)

acids              □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□

0           400          800

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Aspartic acid               32.18         30.54        28.43

Threonine                  20.43         21.09        21.65

Serine                     20.31         20.57        18.42

Glutamic acid              56.92         54.12        50.93

Proline                    21.74         25.65        26.87

Glycine                   30.28         32.41         35.32

Alanine                   31.96         32.17         33.50

Valine                    30.75         31.98         31.74

Methionine                 4.71          4.52          4.19

Isoleucine                 29.05         27.62         27.48

Leucine                   39.49         38.81         36.72

Tyrosine                  10.54          8.43          7.11

Phenylalanine              23.42         23.75         23.83

Histidine                  29.06         32.76         33.52

Lysine                    32.87         30.43         29.58

Arginine                  37.68         35.12         34.03

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Total amino acid          451.39        449.97        443.32

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Table 5. Heat stability of chitosan on antibacterial activity

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60℃  80℃        100℃           121℃

Strains          □□□□□  □□□□□  □□□□□□□□□□□□□□□□ □□□□□□□□□□□□□

60    60    10  20  30  50   10   20   30

□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□

B. subtilis         ++    ++    ++  ++  ++   +    +    +    ±

Sta. aureus        ++    ++    ++  ++  ++   +    +    +    ±

E. coli            ++    ++    ++  ++  ++   +    +    +     +

P. aeruginosa      ++    ++    ++  ++  ++   +    +    ±   ±

Sal. typhimurium   ++    ++    ++  ++  ++   +    +    +     +

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감사

본 연구는 96년도 통상자원부 및 전남도의 산□학□연 컨소시엄 사업에 의해 수행되었으며 연구비 지원에 감사드립니다.

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