Digitalis lanata 현탁배양에 의한 생물학적 변환에서 수성이상계의 이용

최 연 숙, 김 동 일

인하대학교 공과대학 생물공학과

Utilization of Aqueous Two-Phase System in the Biotransformation

Using Digitalis lanata Suspension Cultures

Yeon-Sook Choi, Dong-Il Kim

Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon, Korea

서론

식물세포배양을 통한 유용 이차대사산물의 생산은 식물세포가 지니는 다양한 생물학적 변환 능력을 이용하여 이루어지고 있다. 특히 의학적 가치가 높은 의약품을 생산하고자 하는 목적으로 적극 연구되고 있으며 Digitalis lanata의 현탁세포배양을 통해 digitoxin을 좀 더 유용한 물질인 digoxin으로 전환시키는 것을 그 대표적인 예로 들 수 있다(1). 이 때 생산되는 목적산물인 digoxin은 생물학적 변환반응의 중간산물로서 생성되어 다시 원하지 않는 부산물로 변환되기 때문에 목적산물의 수율 증대를 위해서는 in situ extraction의 도입이 불가피하다. 이에 수성이상계를 in situ extraction 목적으로 이용하고자 한다.

수성이상계는 두 개의 구조가 다른 polymer 수용액들의 혼합이거나 하나의 polymer와 salt 수용액간의 혼합에 의해 형성되는 system으로 80-95 %의 높은 수분 함유량을 지니며 유기용매를 이용한 two-phase system에 비해 낮은 계면장력을 갖는다(2). 더욱이 세포에 미치는 독성 정도가 유기용매에 비해 적으므로 세포와 같은 생촉매를 이용하는 공정에 유용하게 쓰일 수 있다. 여러 수성이상계 중에서 polyethylene glycol(PEG)과 dextran에 의해 형성된 수성이상계는 소수성 물질의 추출에 널리 이용된다(3). 따라서 식물세포를 이용한 digitoxin의 digoxin으로의 생물학적 변환 공정에 PEG/dextran 수성이상계를 적용시켜 소수성을 띠는 digoxin의 in situ extraction을 수행하여 궁극적으로 목적산물의 생산성 증진이 가능하다.

이에 본 연구에서는, Digitalis lanata 현탁배양을 통한 생물학적 변환에 수성이상계를 이용하는 연구의 일환으로서, 목적산물인 digoxin에 대해 높은 분배계수를 보이는 수성이상계를 선별하고 그 system내에서의 세포증식을 관찰하고자 하였다.

실험

세포 및 배지

Digitalis lanata는 독일 T□bingen 대학의 Dr. Wolfgang Kreis로부터 제공받은 cell line K3OHD 캘러스를 변형시킨 MS 배지에 현탁시켜 유도한 것을 9일 간격으로 계대배양하여 유지하였다.

생물학적 변환 반응의 수행을 위해 2단계 배양 방식을 이용하였다(4). 2단계 배양을 위해 생장배지로는 MS 배지를, 생산배지로는 8 %(w/v) glucose 수용액을 사용하였다.

수성이상계 준비

다양한 분자량의 PEG (PEG1450, PEG3350, PEG8000, PEG20000) 수용액들과 dextran (dextran T40, dextran T500, dextran T2000, crude dextran) 수용액들을 조합하여 여러 수성이상계를 준비하였다.

Digoxin 분배 분석

준비된 다양한 수성이상계 10 g에 digoxin을 200 ppm 씩 첨가하여 10분간 혼합 후 24시간 정치한 다음 분리된 윗상과 아랫상을 각기 따로 회수하여 동량의 methanol로 희석한 다음 0.45 □ 막여과지로 여과하여 HPLC 분석을 행하였다.

HPLC 분석은 Phenomenex Curosil-G column (4.6×259 mm, 6 □)을 고정상으로, acetonitrile:water (35:65, v/v) 혼합용액을 이동상으로 이용하여 1 □/min 유속으로, 220 nm의 UV 검출파장에서 수행하였다.

세포증식 측정

암소의 회전식 진탕배양기에서 150 rpm, 25℃의 조건으로 100 □ 삼각플라스크에서 생장배지 30 □에 5 g의 fresh cell을 접종시킨 후 세포의 생장을 관찰하였다. 이러한 관찰을 위해 dry cell weight(DCW)를 측정하였다. DCW는 60℃ dry oven에서 항량이 될 때까지 세포를 건조시킨 후 무게를 측정한 것이다.

결과 및 토론

여러 관련 문헌에서 얻은 정보를 통해 Table 1에 제시된 바와 같은 실험 system을 구축하였다(5). 이러한 system에서 목적산물인 digoxin의 분배경향을 살펴봄으로써 system을 구성하는 polymer의 분자량과 농도에 따른 영향을 조사하며

Digitalis lanata 현탁배양에 의한 생물학적 변환에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 예상되는 system을 선별하였다. Fig. 1은 Table 1에서 보인 다양한 system에서의 digoxin의 분배를 관찰한 결과이다. PEG와 dextran 분자량의 증가에 따라, 그

Table 1. Various aqueous two-phase systems

분류	PEG 조성	Dextran 조성	System No.
PEG 분자량	PEG 3350, 10 %	Dextran T500, 30 %	1
	PEG 8000, 10 %		2
	PEG 20000, 10 %		3
PEG 농도	PEG 20000, 10 %	Dextran T500, 30 %	3
	PEG 20000, 15 %		4
	PEG 20000, 20 %		5
Dextran 분자량	PEG 1450, 2 %	Dextran T500, 20 %	6
		Dextran T2000, 20 %	7
	PEG 8000, 10 %	Dextran T40, 40 %	8
		Dextran T500, 40 %	9
		Dextran T2000, 40 %	10
Dextran 농도	PEG 8000, 10 %	Dextran T500, 30 %	2
		Dextran T500, 40 %	9
	PEG 20000, 15 %	Crude dextran, 3 %	11
		Crude dextran, 4 %	12

리고 농도 증가에 따라 분배계수가 커짐을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에 쓰일 수성이상계는 되도록 고분자량에 고농도인 polymer를 이용하는 것이 바람직할 것으로 생각된다.

Fig. 1. Partition coefficients of digoxin in various aqueous two-phase systems

Fig. 2. Cell growth curves in PEG, Dextran, and PEG/Dextran systems

분배계수(K)가 어느 정도 수준을 만족하며 적당한 volume ratio를 나타내면서 경제적 요인이 고려된 수성이상계로 15 % PEG 20000 / 4 % crude dextran       (K=1.7)을 채택하여 growth 측정 실험을 행하였다(Fig. 2). PEG와 dextran 수용액을 혼합시켜 얻은 수성이상계에서의 세포의 경우 control과 유사한 세포 생장 경향을 보임을 알 수 있었다. 이는 수성이상계가 세포에 독성이 거의 없는 생물친화성이 큰 system이라는 보고와 일치하는 것이다(6).

본 수성이상계를 구성하는 PEG와 dextran은 큰 점도를 갖는 물질이므로 이런 polymer에 의해 형성되어진 수성이상계가 높은 점도를 나타내는 것은 당연한 결과이다. 그런데 높은 점도를 보이는 system의 경우, 세포에 대한 산소 공급과 물질전달 측면에서 불리하므로 이의 해결을 위해 rpm을 조절하여 그에 따른 세포 생장의 영향을 살펴보았다(Fig. 3). 배양시간이 길어짐에 따라 150 rpm에서 배양한 경우가 control에 비해 나은 세포 생장결과를 보임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 배양시간이 연장됨에 따른 산소요구량의 증가에 기인하는 것으로 생각된다.

Fig. 3. Effects of agitation speed on Digitalis lanata cell growth in aqueous

two-phase system (15 % PEG / 4 % crude dextran)

이상의 결과들로부터 Digitalis lanata를 이용한 생물학적 변환에 수성이상계를 이용하는 것이 세포의 생장에 악영향을 미치지 않으면서 목적산물인 digoxin의 수율을 증대시킬 수 있으리라 기대되며 이에 대한 지속적인 연구가 필요하다고 판단된다.

참고문헌

1. Kreis, W. and Reinhard, E.: J. Plant Physiol., 128, 311(1987)

2. Andersson, E. and Hahn-H□gerdal, B.: Enzyme Microb. Technol., 12, 242(1990)

3. Kaul, R. and Mattiasson B.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 259(1986)

4. Kreis, W. and Reinhard, E.: Planta Med., 54, 143(1988)

5. Albertsson, P.: Partition of Cell Particles and Macromolecules, John Wiley &        Sons Inc., New York, 261(1971)

6. Mattiasson, B. and Holst, O.: Extractive Bioconversion, Marcel Dekker, Inc., New     York, 173(1991)