Thiophilic PolyHEMA 제조에 관한 연구

- DVS(divinylsulfone)의 초기농도와 완충액 pH의 영향

임재홍, 김환기*, 허형회*, 한학수, 김중현, 조영일

연세대학교 공과대학 화학공학과

삼양사 중앙연구소 화성연구실*

A Study on the Preparation of Thiophilic PolyHEMA

- The Effects of Initial Concentration of DVS and pH of Buffer

Jae-hong Im, Whan-gi Kim*, Hiung-hoi Hur*,

Hak-soo Han, Jung-hyun Kim, Yung-il Joe

Dept. of Chem. Eng. College of Eng., Yonsei Univ.

Chemical Research Dept. of Samyang group R&D center*

서 론

Thiophilic 흡착은 1985년에 Porath[1] 등에 의해서 제안된 새로운 크로마토그래피법이다. Porath 등은 □thiophilic□이라는 일종의 크로마토그래피 리간드에 대하여 언급하였었다. 현재 제안되고 있는 일반적인 구조의 thiophilic 구조는 다음과 같다.

P―O―CH2CH2SO2CH2CH2―R

P : 고체상의 고분자

R : 말단 리간드, 1 또는 2

1. thioether

2. 전자 공여기가 접합된 이차 amine 이나 ether 결합[2]

Thiophilic 크로마토그래피는 혈청[1], 복막액[3], 조직배양 부양액[4], 초유 유청[5], 치즈 유청[6]에서 Ig을 직접 정제하는데 사용된다. Thiophilic 크로마토그래피는 Ig와 결합하며 (NH4)2SO2, K2SO4 같은 물 구조화 염(water-structuring salts)의 존재하에서 다른 단백질[7]과도 결합하며, 결합된 단백질들은 NaCl을 포함하는 완충액을 사용하여 세출된다. 화학적 안정성, 그리고 리간드의 높은 비특성은 연구자들로 하여금 thiophilic 담체를 Protein A, G와 같은 단백질 친화성 리간드의 대체물로서 많은 관심을 유발시켰다.

본 연구에서 우리는 사람의 혈액과 혈장으로부터 IgG를 선택적으로 흡착하기 위해서 thiophilic 성분이 결합된 생체친화성 흡착제를 제조하고자 하였다. 우리는 기본적 고상 담체로서 친수성 고분자이며, 생의학 응용에서 많은 주목을 받고 있는 PolyHEMA[8,9]을 선택하였으며, 이 PolyHEMA 미세구들을 분산중합법으로 제조하였다[10,11]. 이 미세구들을 DVS로 활성화시키고, □-mercaptoethanol을 미세구의 활성면들에 공유결합시켰다. 이 때 활성화 반응에서 사용하는 완충액의 pH와 DVS의 초기농도를 변화시켜 이들이 PolyHEMA 미세구들의 thiophilic화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

실험 방법

기본 담체인 PolyHEMA는 2-hydroxyethyl methacrylate(Aldrich), ethylene dimethacrylate(Aldrich), poly (N-vinyl-2-pyrrolidone) K-90(Fluka), azobis (isobutyro- nitrile)(Aldrich)를 사용하였으며, cyclohexanol과 1-octhanol은 국내 생산품을 사용하였다. 이 때 PolyHEMA 입자의 제법은 문헌[10,11]과 같다.

제조된 PolyHEMA는 세척□건조과정을 거치고, standard sieve를 이용하여 210 □ 이하 크기의 입자로 분류하여 활성화 및 결합반응에 사용하였다. 활성화 및 결합 반응은 DVS(divinylsulfone)(Aldrich), □-mercaptoethanol(Sigma), Na2CO3, NaN3를이용하였다. 이 때 초기 활성화물의 농도(0.3, 0.5, 0.7, 1.0 M)와 완충액의 pH를 제조변수로 하였다. 제조된 활성화물은 증류수와 Acetone으로 산성을 띠지 않을 때까지 세척하여 결합반응에 사용하거나 4 ℃에서 Acetone에서 보관하였다. 세척된 활성화물을 증류수로 세척한 후 결합반응물 역시 증류수로 세척하였으며 4 ℃에서 0.02 %의 NaN3에 보관 하였다.

각 단계별로 제조된 PolyHEMA 입자들은 FT-IR로 반응상태와 결합형태를 알아보았으며, Porosimeter로 기공도의 변화를 측정하였고, CHNSO와 XPS를 통하여 결합된 황의 양을 측정하였다.

결과 및 토론

Fig. 1의 FT-IR peak 변화를 통해서 DVS과 □-mercaptoethanol를 이용한 PolyHEMA의 활성화 및 결합반응이 이루어졌음을 알 수 있었다. 기본 담체인 PolyHEMA[a]에는 없는 -SO2- 결합이 활성화된 PolyHEMA와 결합된 PolyHEMA에서는 각각 1290 및 1360 nm에서 발현되고 있다. 이는 660 nm에서 발현된 C-S 결합를 통해서도 확인할 수 있었다.

Fig. 2는 1.0 M의 DVS(medium pH 11.5)로 활성화된 PolyHEMA의 XPS wide-spectra이다. 고분자의 주쇄인 탄소와 산소의 피크가 각각 288.40, 538.75 eV를 중심점으로 하여 나타났으며, 황의 피크는 174.40 eV에서 나타났다. 기본담체인 PolyHEMA에는 존재하지 않는 황을 감지함으로써 활성화가 이루어졌음을 알 수 있었다.

Fig. 3은 각 DVS 농도별로 제조된 활성화 PolyHEMA의 XPS spectra이다. 이를 이용해 결합된 S의 양을 계산해 본 결과 0.3 M의 경우 13.9, 0.5 M의 경우 15.0, 0.7 M의 경우 16.7, 1.0 M의 경우 14.7 (□/g PolyHEMA)로 결합되었음을 알 수 있었다. 따라서 DVS의 농도는 0.7 M로서 최적화되었다.

참 고 문 헌

1. J. Porath, F. Maisano and M. Blew, FEBS Lett., 185 (1985), 306

2. K.L. Knudsen, M.B. Hanson, L.R. Herickson, A. Lihme, Anla. Biochem.,

201 (1992), 170

3. M. Blew, N. Juntti, A. Larson and J. Porath, J.of Imm. Methods, 102 (1987) 173.

4. B, Nopper, F. Kohen and M. Wilchek, Anal. Biochem., 1989, 66-71.

5. T.W. Hutchen, J.S. Magnusen and T.T. Yip, J. of Imm. Methods,

128 (1990) 89.

6. P. Konecny, R.J. Brown and W.H. Scouten, J.of Chrom. A, 673 (1994) 45

7. T.W. Hutchens and J. Porath, Biochemistry, 26 (1987)

8. Alec B. Scranton, Antonios G. Mikos, J. of App. Pol. Sci., vol.40, 997-1004         (1990).

9. A. Jayakrishnan, B. Chithabara Thanoo, J. of Biomedical materials Research,         vol.24, 913-927(1990).

10. 임재홍, 한학수, 김중현, 조영일, 화학공학의 이론과 응용, 제2권, 제2호,

1331-1334 (1996)

11. 임재홍, 오경석, 한학수, 김중현, 조영일, 화학공학의 이론과 응용, 제3권,

제1호, 1217-1221 (1997)

감 사

이 논문은 삼양사의 연구비 지원으로 수행되었으며, 이에 감사의 뜻을 표합니다.

Fig. 1. FT-IR spectra of PolyHEMA

[a] PolyHEMA

[b] Activated PolyHEMA with DVS

[c] Coupled PolyHEMA with □-mercaptoethanol.

Fig. 2. XPS Spectrum of Activated PolyHEMA with 1.0 M DVS.

Fig. 3. XPS Spectra of Activated PolyHEMA

(a) 0.3 M DVS

(b) 0.5 M DVS

(c) 0.7 M DVS

(d) 1.0 M DVS.