recA::luxCDABE를 포함한 재조합 E. coli를 이용한

DNA-damage 관련 Stress 탐지

민 지 호·최 수 형·김 중 현·구 만 복·Robert A. LaRossa*

광주과학기술원 환경공학과

*Central Research and Development DuPont Company, USA

The Stress Response of recombinant E. coli cells

harboring recA::luxCDABE

Ji Ho Min·Sue Hyung Choi·Jung Hyun Kim·Man Bock Gu·

Robert A. LaRossa*

Dept. of Environ. Sci. & Eng., KJIST, Kwangju, Korea

*Central Research and Development DuPont Company, USA

서 론

Bioluminescence는 외부화합물질에 의해 유도되고, 효소에 의해 촉매되는 미생물의 빛 방출 반응으로 bioluminescent bacteria의 lux system은 유전자 발현과 세포대사정도를 측정하는데 응용되어져 왔다.

박테리아는 성장중에 여러 가지 stress로 인해 단백질 손상, DNA 손상, membrane 손상등을 입어 성장에 방해를 받게 되는데, 이때 마다 heat shock regulon과 oxidation stress regulon, SOS regulon등의 조절 유전자들이 발현하여 stress를 감소시킨다.  특히 이들 regulon중, SOS regulon은 세포내의 DNA가 손상을 입었을 때 작동하게 되는데, 그 중 중점적인 역할을 하는 것이 recA promoter이다 (1).  recA promoter는 UV나 mutagen등에 의해 DNA가 손상되거나, DNA 복제에 방해를 받게 되면, turn on되는 특징을 가지고 있어 recA promoter과 repoter로서 lux 유전자를 융합시켜 개발된 재조합 균주 E. coli DPD2794는 genotoxic agents에 의한 DNA 손상 정도를 lux 유전자의 발현을 통한 빛 방출정도로 신속하게 측정할 수 있어 고감도 sensor로서의 개발을 연구중에 있다 (2).

현재 환경내에 널리 퍼져 있는 독성물질들의 독성정도를 측정하는 방법과 기기들은 많이 개발되었지만, 이들 독성물질이 박테리아에 미치는 genotoxicity에 대해서 정밀히 측정할 수 있는 방법의 개발은 아직 미비하다.  따라서 본 실험실에서는 genotoxic agents로 인한 박테리아내의 DNA 손상을 신속 정확하고, 정량화하여 분석할 수 있는 bioluminescence biological sensor의 개발을 위하여 여러 가지 genotoxic agents를 가지고 이로 인한 빛 방출 반응을 조사하였다.

이 론

박테리아가 UV나 genotoxic agents에 의해 DNA 손상을 입었을 때, 이를 회복시키기 위해 20개 정도의 유전자가 유도 되어지는데, 이를 SOS 반응이라고 한다.  E. coli내에서의 SOS 반응의 조절은 주로 recA과 lexA 유전자의 생성물에 의해 일어난다.  RecA 단백질은 DNA 손상으로 인한 SOS 유도신호가 발생하게 되면 SOS 반응 유전자들의 발현 억제제로 작용하는 LexA 단백질을 분해하여 SOS 반응이 시작되고 DNA 손상이 회복된다.  고로 RecA 단백질은 DNA 손상으로 인한 SOS 유도신호와 SOS 반응 유전자의 발현을 연결해 주는 작용을 하고, 따라서 DNA 손상을 판단하는데, RecA 단백질의 발현 즉, recA promoter의 turn on이 중요한 역할을 한다.  우리가 보유하고 있는 있는 균주인 DPD2794의 경우는 recA promoter와 유전자 발현 정도를 쉽게 판단할 수 있는 lux 유전자가 융합되어 있는 재조합 plasmid를 포함하고 있다 (Fig. 1).  따라서 DNA 손상이 발생하면 recA promoter가 lux 유전자를 발현시켜 bioluminescence가 일어나게 된다.  고로 recA promoter를 가진 DPD2794는 DNA 손상을 야기하는 독성 화학물질에 대한 위험 정도를 판단하는데 유용하게 이용되어 질 수 있을 것이다.

Genotoxic

agents

SOS 신호

DNA 손상                  recA promoter 켜짐

luciferase 생성

Bioluminescence 발생

Luminometer로 측정

Figure 1. Genotoxic agents에 민감하게 반응하는 재조합 E. coli DPD2794            의 작동 mechnism.

실험방법

본 실험에서는 E. coli의 SOS response promoter (RecA)에 V. fischeri의 lux system을 reporter gene으로 삽입시킨 plasmid를 함유하는 E. coli DPD27940를 사용하였다.  이 균주는 25□g/mL의 kanamycin (sigma)이 첨가된  Luria-Bertani (LB) 배지 상에서 30 ℃, pH 7.5, 250 rpm의 조건으로 shaking incubator (Forma Scientific)에서 배양하였다.  100 mL의 LB배지에서 8시간정도 자란 균주의 2 mL씩을 각 플라스크에 접종하고 OD600가 0.08정도 당하는 지점에서 독성물질을 첨가하여 Bioluminoscene를 측정하였다.  이때 방출되는 빛의 세기는 luminometer (TUNER TD-20e)로 측정하였으며 균체의 성장정도는 UV/vis spectrometer (PERKIN ELMER) 상에서 측정하였다.  실험에 사용된 화학물질은 모두 Sigma에서 구입하였다.

결과 및 토론

일반적으로 DNA 손상을 입힌다고 알려진 여러 mutagens과 단백질 구조를 변형시킴으로서 stress반응을 일으키는 phenol류에 대한 DPD2794의 반응을 실험하였다.  Stress 반응의 정도는 volumetric light emission을 세포의 optimal density (OD600)로 나눈 specific bioluminesence (SBL)로 측정하였다. 이들 mutagens의 경우, 어느 정도의 농도까지는 비례적인 SBL의 증가를 보이나, 어느 한도가 넘어서면 대조군보다도 낮은 수준의 SBL값을 보이고 있다.

Mitomycin C의 경우

Mitomycin C는 antibiotics로 DNA의 반보존적 복제시에 두 strand의 DNA가 분리되는 것을 방해하는 작용을 하는 mutagen으로 세포의 성장에는 그다지 영향을 미치지 않는 범위내에서 눈으로도 식별이 가능한 다량의 빛을 방출하였다.  이 경우 2ppm(2□/□)에서 가장 많은 양의 빛이 방출되었는데, 그 때의 SBL값은 975,509이었다.  또한 mitomycin C가 배지내로 삽입된지 30분 후부터 대조군이 방출하는 빛과 4배 정도의 차이가 발생하고 80분 정도가 지나면 20배 정도로 그 차이가 점점 커지게 된다.  따라서 mutagens이 세포내의 DNA에 미치는 영향을 상당히 빠르고 쉽게 관찰할 수 있다는 것을 알 수 있다.

Hydrogen Peroxide (H2O2)의 경우

0.007%와 0.002%가 서로 비슷한 SBL값을 나타내었고 0.02%의 경우에는 성장저해도 상당히 있었고, 그에 따라 빛 방출역시 미비하여 light off로 나타났다.  Mitomycin C에 비하면 많은 양은 아니지만 대조군과 비교하여 7배 정도의 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다.  또한 대조군의 빛이 거의 감소된 후부터 빛이 증가하는 형태는 mutagens에서만 나타나는 반응 지연 현상인데, oxidating agents로 알려져 있는 H2O2에서도 이러한 형태의 그래프를 관찰하였다.  따라서 H2O2역시 DNA에 상당히 손상을 입힌다는 것을 확인하였다.

Phenol류의 경우

주로 membrane과 단백질에 손상을 입히는 것으로 알려진 phenol류 (2-chlorophenol, o-cresol, phenol등)에 대해서도 반응 정도를 비교하는 실험을 실시하였다.  결과 그래프는 나타내지 않았지만, 대부분의 농도에서 대조군의 빛 방출량과 비슷하거나 훨씬 못 미치는 정도의 빛을 방출하였다.  따라서 독성 물질에 대한 DPD2794의 고감도 빛 방출은 DNA에 손상을 입히는 mutagen에 대해서만 발생한다고 할 수 있다.

이상의 결과에서 알수 있드시, 적은 농도의 mutagens에 대해서는 발생하는 빛의 양의 차이로, 높은 농도의 mutagens에 대해서는 세포의 성장저해 정도의 관찰로 인해 어떠한 mutagens의 유해성 정도를 판단할 수 있다.  또한 recA promoter와 lux 유전자가 융합된 DPD2794는 DNA에 손상을 입히는 mutagens에 대해서만 고감도의 빛을 발생한다.  따라서 환경을 오염시키고 있는 여러 genotoxic agents뿐만 아니라 요사이 문제시 되고 있는 방사선까지도 유해성유무를 정량적으로 분석할 수 있는 센서로 작용할 수 있을 것이다.

참고문헌

1. Mandana Sassanfar and Jeffrey W. Roberts. 1990. Nature of the              SOS-inducing siganl in Escherichai coli. J. Mol. Biol. 212:79-96.

2. Amy C. Vollmer, Shimshon Belkin, Dana R. Smulski, Tina K. Van Dyk,       and Robert A. LaRossa. 1997. Detection of DNA damage by use of           Escherichia coli carrying recA'::lux, uvrA'::lux, or alkA'::lux reporter         plasmids. Appl. Env. Microbiol. 63, 7:2566-2571.

3. Rupani S. P., Man Bock Gu, Konstantinov van Dyk, T. K. and Robert A.      LaRossa. 1996, Charaterization of the stress response of a biological sence     of in batch and continuous cultures. Biotechnol. Prog. 12:387-392.

(a)                                   (b)

Figure. 2 The effect of pulsed of mitomycin C on (a) cell growth and (b)               induced specific bioluminesence profiles obtained in a batch flask              cultivation in LB medium at 30 ℃

(a)                                    (b)

Figure. 3 The effect of pulsed of H2O2 on (a) cell growth and (b) induced               specific bioluminesence profiles obtained in a batch flask cultivation            in LB medium at 30 ℃