생체분해성 Poly(DL-lactide-co-glycolide) 랜덤공중합체 Micelle에서 약물방출(Ⅰ)

이동병, 차월석, 나재운*

조선대학교 공과대학 화학공학과, *순천대학교 공과대학 고분자공학과

Release of Clonazepam from Biodegradable Poly(DL-lactide-co-glycolide) Random Copolymer Micelles(Ⅰ)

Dong-Byung Lee, Wol-Suk Cha, Jae-Woon Nah*

Dept. of Chem. Eng., Chosun Univ., Kwangju 501-759, Korea

*Dept. of Polymer Sci. and Eng., Sunchon Nat'l Univ., Sunchon 540-742, Korea

1. 서 론

Polyesters, polyamides, polyolefins, hydrogels 등의 고분자는 인공장기, 인공혈관, 수술용 봉합사, 인공피부, 고분자 의약[1] 등의 의료분야에서 많은 관심과 기대 속에 연구개발되고 있다. 생체분해성 고분자에서 분해특성을 좌우하는 인자로서는 화학구조, 결정화도, 유리전이온도, 사슬의 유연성, 분자량 분포 및 중합촉매의 영향 등이 있으며  분해인자의 변화에 따라 적당한 분해특성을 가지는 고분자를 만들 수 있다[2,3]. Polyesters에서도 polylactic acid와 polyglycolic acid는 가장 안전성있는 고분자로 상호간에 보완적인 특성을 지니고 있어 반응조건에 따라 생체분해성 고분자로서 다양한 특성을 갖게 되어 그 가능성을 기대 받고 있다[4,5]. 향정신성 의약품인 benzodiazepam계 약물은 정신 및 자율신경발작, 불안증세 등에 사용되고 있으며, 치료에 요구되는 시간이 오래 걸릴 뿐만 아니라 장기간 복용으로 인한 약물의 과잉투여는 인체에 심각한 문제점들을 야기시키고 있다. 따라서 보건당국은 약물의 오용으로 인한 약물의 의존성을 막기 위해  법적인 대책을 강구하고 있다. 그러나, benzodiazepam계 약물이 통상적인 치료제로 사용되고 있는 실정에 있으며, 치료에 사용되는 약물은 짧은 체내 반감기 및  과잉 혈중농도로 인한  부작용으로 치료를 더욱 어렵게 하고 있다. 따라서 적당량의 투여와 장시간에 걸쳐 유효혈중농도를 유지시키는 DDS를 이용한 약물이 절실히 요구되고 있다. 본 연구에서는 copolymer poly(DL-lactide-co- glycolide)(DL-PLGA)(70:30,80:20,90:10)과 homopolymer인 poly DL-lactide(DL-  PLA), poly glycolide(PGA)를 합성[4]하였다. 합성된 고분자의 물성 및 물리화학적 특성을 고찰하고 homopolymer와 copolymer를 약물전달체(DDS)로서의 사용 가능성을 비교검토하기 위하여 모델약물인 clonazepam으로 약물 방출실험을 하여였다.

2. 실 험

2.1. 시약 및 기기

Glycolic acid(70wt.%), DL-lactic acid(85wt.%), 등은 Aldrich Chem. Co.의 특급시약을, stannous octoate(95%)는 Sigma Chem. Co.의 특급시약을, antimony trioxide은 Juncei Chem. Co.의 1급시약을 사용하였다. 기기로는 FT 1H-NMR spectrophotometer(Bruker AC-300F, 300MHz), DSC(Mettler Co. DSC 30), GPC column(Shimazu GPC-800series)등을 사용하였다.

2.2. 합성방법

2.2.1. DL-PLGA(70:30, 80:20, 90:10) copolymer의 합성.

DL-lactide 7.0g, glycolide 3.0g, lauryl alcohol 0.1g 및 stannous octoate 0.3g을 삼구플라스크에 넣고 질소기류하에서 200℃로 하여 4시간 동안 반응시켰다. 얻어진 생성물을 ethyl acetate-petroleum ether 혼합용매에서  추출한 후 동결건조하여 PLGA(70:30)을 얻었다. DL-PLGA와 약물의 합성비가 80:20과 90:10인 경우에도 위와 동일한 방법으로 합성하여 각각 DL-PLGA(80:20, 90:10)을 얻었다.

2.2.2. DL-PLA 및 PGA homopolymer의 합성.

DL-lactide 1.0g과 glycolide 1.0g을 각각 lauryl alcohol 0.1g 및 stannous octoate 0.3g을 삼구플라스크에 넣고 질소기류하에서 반응온도를 220℃로 하여 4시간 동안 반응시켰다. 얻어진 생성물을 ethyl acetate-petroleum ether 혼합용매로 추출한 후 동결건조하여 각각의 DL-PLA와 PGA를 얻었다.

2.2.3. DL-PLGA를 이용한 micelle의 제조

DL-PLGA(70:30, 80:20, 90:10)와 clonazepam의 혼합비를 20:20 으로 만든 다음 각각 실온에서 DMF 4ml에 용해시켰다. 이 약물이 녹아 있는 고분자용액을 투석막(cellulose membrane)에서 증류수에 침지시켜 24시간 동안 투석한 후 동결건조하여 미색의 micelle을 얻었다.

2.2.4. DL-PLA와 PGA의 매트릭스 제조

DL-PLA 20□을 실온에서 chloroform 3□에 녹인 후, 각각 clonazepam 20□을  혼합용해시켰다. 약물이 혼합된 고분자 용액을 액체질소에서 응고시킨 후 3일 동안 동결건조하여 DL-PLA 매트릭스를 제조하였다. PGA 매트릭스는 PGA 20□을 가온하여 DMF 3□에 녹인 후, 각각 clonazepam 20□을 혼합용해시켰다. 약물이 혼합된 고분자 용액을 감압하에서 가온하여 3일 동안 용매를 증발시켜 PGA 매트릭스를 제조하였다.

2.2.5. 약물방출실험

micelle, DL-PLA 및 PGA 각각 4mg을 phosphate buffer solution(PBS) pH 7.4, 37.0±0.5℃의 조건으로 100rpm의 속도로 교반시켜 방출실험을 하였으며, UV-Sepctrophotometer로 306nm에서 방출된 약물의 정도를 측정하였다. 시료채취 후 즉시 새로운 동량의 PBS를 넣어 동일한 조건에서 시행하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. DL-PLGA(70:30, 80:20, 90:10), DL-PLA 및 PGA의 구조확인

DL-PLGA(70:30)(1H-NMR,CDCl3):□(ppm)=1.55-1.89(3H,-CH3),4.67-4.91(2H-CH2)

DL-PLGA(80:20)(1H-NMR,CDCl3):□(ppm)=1.55-1.61(3H,-CH3),4.72-5.00(2H-CH2)

DL-PLGA(90:10)(1H-NMR,CDCl3):□(ppm)=1.55-1.60(3H,-CH3),5.14-5.23(2H-CH2)

DL-PLA(1H-NMR,CDCl3):□(ppm)=1.55-1.60(3H,-CH3), 5.13-5.26(1H-CH)

PGA(1H-NMR,(CF3)2CHOD):□(ppm)=4.91-4.99(2H,-CH2)

3.2. 물리화학적 특성확인

3.2.1 물리적 특성

고유점도[□]는 용매 chloroform에 녹여 Ubbelohde 점도계로, 평균분자량(Mw)은 용매 THF에 녹여 GPC column에서 측정하였다. 또한 유리전이온도는 DSC를 사용하여 측정하였으며 그 결과는 Table 1과 같다. 고분자는 결정화도가 클수록

Table 1. Properties of DL-PLGA(70:30, 80:20, 90:10),  DL-PLA, DL-PLGA in

inherent viscosity, mean weight, and glass transition temprature

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a            b           c           c

Polymer               [□]           Mw          Tg       mp

□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□

DL-PLGA(70:30)       1.246         127,000      45          -

DL-PLGA(80:20)       1.095        112,000      48          -

DL-PLGA(90:10)       1.221        124,000      58          -

DL-PLA               0.72           64,000      65          -

PGA                  1.07           85,000       -         198

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a. Measured by Ubbelohde viscometer, solvent: CHCl3, (CF3)2CHOH),

con.:0.2g/□, temp.:25℃

b. Measured by GPC, solvent:THF, con.: 0.01□/□

c. Measured by DSC, heating rate:10℃/min

강도, 밀도, 융점이 높아진다. 결정화도가 높은 고분자는 분자간 응집력이 크고 분자고리의 유동성이 작으므로 물의 투과성이 낮고 생체와의 접촉성이 낮으므로 분해되기 어렵다. 저분자량의 올리고머인 경우에는 쉽게 분해되지만 고분자량인 경우에는 쉽게 분해되지 않는데 이는 수소 결합과 같은 분자간 응집력이 크기 때문으로 설명된다. 또한 부분 결정성 고분자에 대한 생분해는 무정형부분부터 시작되어 결정부분으로 확산된다. 따라서 DL-PLGA는 random 공중합체로서 규칙적인 반복구조가 상실되고 융점 강하가 수반되며, 각각의 단량체인 poly DL-lactide나 poly glycolide에 비해 가수분해 속도가 빠르게 진행된다. DL-PLGA, DL-PLA 및 PGA 중합반응의 조건변화 즉, 분자량 분배감소, 분자량 증가 등의 효과를 가져오는 stannous octoate 촉매, 분자량 조절제인 lauryl alcohol, 반응온도, 반응기구, 반응시간, 용매선택 등에 의해 점도, 분자량, 유리전이온도, 결정화도 등에 의해 물성을 선택할 수 있어 반응제어가 가능하였다.

3.2.2 약물방출실험

DL-PLGA(70:30, 80:20, 90:10)로 제조된 micelle의 형태를 관찰하기 위해서 scanning electron microscope(SEM)으로 확인한 결과 1.0∼2.2□ 정도의  균일하고 안정된  micelle을 형성하였다. DL-PLGA의 종류 및 DL-PLGA와 약물의 함량비에 따라서는 별 다른 크기의 차이를 보이지 않았다. DL-PLGA는 glycolide 단위가 고분자 주쇄에 임의로 분포하며, lactide의 메틸기가 적어지므로 DL-PLA 보다 화학적으로 친수성이고 PGA보다 소수성을 보인다. 결과적으로 친수성과 소수성의 정도 차이에 의해 계면활성제와 같은 현상을 보여 micelle을 형성하게 되는 것으로 사료된다. 이때 micelle에 함유된 약물의 무게퍼센트는 각각 25.44%, 23.40%, 22.34%였다. PBS pH 7.4를 이용한 in vitro 약물전달시스템에서 DL-PLGA micelle, DL-PLA와 PGA 매트릭스는 균일분해가 일어난다. 즉 전체적으로 균일하게 수화, 팽윤, 절단의 단계가 진행된다. 따라서 약물은 표면침식보다는 확산에 의해 방출되는 거동을 보인다. 약물전달체인 DL-PLGA와 약물의 양이 20:20 무게비로 제조된 micelle로부터 소수성 약물이 선형적으로 지연되는 방출시간의 범위는 DL-PLGA(70:30)인 경우가 45일로 가장 길며, 그 다음이 DL-PLGA (80:20)으로 41일 이고  DL-PLGA(90:10)은 34일로 가장 짧은  방출시간을 보였다. 또한 방출된 약물퍼센트는 DL-PLGA(90:10)의 경우가 96%로 가장 많았으며, DL-PLGA(80:20)는 94%, DL-PLGA(70:30)는 87%를 보였다. DL-PLA와 약물의 양이 20:20 무게비로 제조된 매트릭스의 경우 방출된 시간의 범위는 약 3개월정도로 지연효과가 너무 크다. PGA의 경우는 초기과잉 방출 현상을 나타냈으며, 방출된 약물퍼센트는 71.3%를 보여(Table 2) 약물전달체로 사용하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.

Table 2. Linearly released time range of drug from DL-PLGA(70:30,80:20,90:10)

micelles, DL-PLA and PGA matrices  in pH 7.4 PBS at 37℃

Drug carrier type	Time range(days)	Released amount(%)
PLGA(70:30) micelles	45	87
PLGA(80:20) micelles	41	94
PLGA(90:10) micelles	34	98
DL-PLA matrices	93	92
PGA matrices	10	71.3

* Drug and polymer ratios of carriers were prepared in the weight ratio

20:20 of DL-PLGA, DL-PLA, and PGA and drug

4. 결 론

본 연구에서는 DL-lacide와 glycolide의 혼합비가  각각 70:30, 80:20 및 90:10인 DL-PLGA, DL-PLA 및 PGA를 합성하였다. 합성된 고분자의 물성 및 물리화학적 특성을 고찰하고 homopolymer와 copolymer를 약물전달체로서의 가능성을 비교검토하였으며, 그 결과는 다음과 같다.

DL-PLGA, DL-PLA 및 PGA의 중합반응 조건의 변화에 의해 각각 다른 물성을 가진 고분자를 얻을 수 있었다. micelle로부터 약물방출을 지연시키는 시간범위는 DL-PLA>DL-PLGA(70:30)>DL-PLGA(80:20)>DL-PLGA(90:10)>PGA의 순서였으며, 약물 방출퍼센트는 PGA>DL-PLGA(90:10)>DL-PLGA(80:20)>DL-PLGA (70:30)> DL-PLA의 순서였다. DL-PLA로 제조된 매트릭스의 경우에는 약물방출 지연효과가 크지만 억제력이 너무 크고 PGA로 제조된 매트릭스의 경우는 초기에 과잉방출 현상을 보여 약물전달체로 사용하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다. 결론적으로 본 실험에서 diafiltration법으로 제조한 micelle은 균일한 크기로 제조할 수 있어 약물전달시스템(DDS)에서 지연성 및 정맥주사용 제제로의 응용이 기대된다.

5. 참고문헌

1. Gutch, C. F.: Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 4, 405(1975).

2. Chu, C. C.: J. Biomed. Mater. Res., 19, 437(1985).

3. Tokiwa, Y. and  Suzuki, T.: Agric. Biod. Chem., 41, 265(1977).

4. Reed, A. M. and  Gilding, D. K.: Polymer, 22, 494(1981).

5. Wasserman, D.: U. S. Patent 3,375,008(1981).