Horseradish Peroxidase에 의한 PCP(pentachlorophenol)의 산화반응메카니즘 연구

최 유 진,  채 희 정*,  김 의 용

서울시립대학교 화학공학과, *미원(주) 중앙연구소 생물공학팀

Mechanism Study of PCP(pentachlorophenol) Oxidation by Horseradish Peroxidase

Yu Jin Choi,  Hee Jeong Chae*,  Eui Yong Kim

Dept. of Chemical Engineering, The University of Seoul

*Biotechnology Division, R&D Center, Miwon Co., Ltd.

서론

난분해성 화학물질을 처리할 수 있는 방법들은 물리적, 화학적, 생물학적 처리 등 매우 다양하다. 근래에 와서 생물학적 처리방법이 많은 관심을 모으고 있으나 처리할 수 있는 농도에 한계가 있고 장시간 처리를 해야한다는 단점이 있다.  이와 같은 단점을 보완할 수 있는 방법이 효소를 이용한 처리법이다. 효소를 이용한 처리공정은 온도나 pH 등의 반응조건을 맞추기가 용이하고 처리시간이 상당히 짧고 고농도처리가 가능하다는 장점을 가지고 있다.[1,2]

Horseradish Peroxidase는 H2O2와 함께 PCP를 산화시켜 라디칼을 생성시킨다.

2 PCP + H2O2 [eqn: ->] 2 P* + 2 H2O  (여기서, P*는 PCP라디칼을 의미한다.)

생성된 라디칼은 상호 반응하여 물에 불용성인 고분자를 형성하여 침전되는데 이들은 여과나 원심분리에 의해 쉽게 제거된다.

본 연구에서는 HRP(Horseradish Peroxidase)를 이용한 PCP의 산화반응에 대한 메카니즘을 제안하였으며, 실험을 통해 매개변수의 값을 구함으로써 반응메카니즘의 타당성을 검토하였다.

실험

본 실험에서 사용한 HRP (type II)와 Catalase는 Sigma사에서 구입하였다. 실험은 25℃의 항온조에서 인산염 완충용액을 사용, 200rpm으로 교반하면서 진행되었다.

PCP의 농도는 다음의 방법으로 측정하였다.[3,4]

① 일정량의 반응물을 채취한 후 Catalase를 첨가하여 반응을 종결시킨다.

② 생성된 고분자물질이 용이하게 침전되도록 Al2(SO4)3를 첨가한다.

③ 원심분리시켜 고분자물질을 제거한 후 320nm와 360nm에서 상등액의 흡광도를 측정하여 흡광도값의 차를 이용하여 PCP의 농도를 계산한다.

결과 및 고찰

HRP에 의한 PCP의 산화반응을 ping-pong bi-bi 메카니즘에 의해 다음과 같이 제안하였다.

H2O2            H2O   PCP              P*   PCP                  P* H2O

E  (E·H2O2→Ei·H2O)   Ei     (Ei·PCP→Eii·P*)    Eii    (Eii·PCP→E·P*·H2O)       E

E*          Ei

E                      Ei*

Eii*         Eii

제안된 메카니즘으로부터 PCP분해에 대한 효소반응 속도식을 유도하기 위해 다음과 같은 가정을 적용하였다.

첫째, 반응초기에는 반응생성물인 H2O와 P*의 농도가 매우 낮으므로 이들이 생성되는 반응단계는 비가역적이다.

둘째, 마지막 단계의 반응을 율속이라 가정하였다.

Eii*              E + H2O + P*

따라서 전체반응속도는  V0 = k6 Eii* 이 된다.

King & Altman Procedure를 이용하여 효소반응 속도식을 유도하면 다음과 같다.

[eqn: V_0 ~ =~ {V_max `` [H_2 O_2 ]_0~ [PCP]_0} over { K_ma ~[PCP]_0~ +~ K_mb~ [H_ 2 O_2 ]_0 ~+~ [H_2 O_2 ]_0~ [PCP]_0 }]                식(1)

여기서 [eqn: K_ma]과 [eqn: K_mb]는 각각  H2O2가 포화상태에서 [eqn: { V_max} / {2}]의 속도값에 해당하는 PCP의 농도와 PCP가 포화상태에서 [eqn: { V_max} / {2}]의 속도값에 해당하는 H2O2의 농도를 나타내며 다음의 값을 갖는다.

[eqn: K_ma ~=~ {{k_-1~ +~ k_2 } over {k_1 k_2 }} over{ { 1} over {k_2 }+ { 1} over {k_4}+ { 1} over {k_6 } }] ,    [eqn: K_mb ~=~{{(k_-3 ~+~k_4 )} over {k_3 k_4}~+~{(`k_-5 ~+~k _6 )} over {k_5`k_6}}over{{ 1} over {k_2 }+ { 1} over {k_4 }+ { 1} over {k_6 } }]  식(2)

PCP와 H2O2가 모두 포화농도일 때 반응속도가 최대로 되므로 [eqn: V_max]는 다음과 같이 유도된다.

[eqn: V_max ~= ~{1} over { { 1} over {k_2 }+ { 1} over {k_4 } + { 1} over { k_6} }~[E]_0 = K_cat ~[E]_0]                             식(3)

여기서 [eqn: K_cat]는 PCP에 대한 HRP의 catalytic turnover number로 다음과 같다.

[eqn: K_cat ~=~{1} over { { 1} over {k_2 }+ { 1} over {k_4 } + { 1} over { k_6} }]                            식(4)

H2O2의 농도가 과량인 경우 H2O2에 의한 기질저해현상을 고려하면 식(1)은 다음과 같이 변환된다.

[eqn: V_0 ~=~{V_max ~[H_2 O_2 ]_0~ [PCP]_0} over { K_ma ~[PCP]_0 ~+~ (K_mb ~+~[PCP]_0 `)~(`1~+~ {[H_2 O_2 ]_0} over {K_i }`) ~[H_2 O_2 ]_0 }]    식(5)

여기서 [eqn: K_i]는 inhibition constant 이다.

H2O2와 PCP의 초기농도를 동일하게 하여 [H2O2]0 = [PCP]0 = [S]0 라 놓으면 초기속도식은 다음과 같이 유도된다.

[eqn: V_0 ~=~{V_max ~[S]_0`^2} over { K_ma ~[S]_0~ +~ (K_mb ~+~[S]_0`)~(`1~+~ {[S]_0} over {K_i })~ [S]_0 }]

[eqn: ={k_cat ~[E]_0 ~[S]_0} over {(K_ma `+~K_mb `) ~+~(`1~+~ {K_mb}over{K_i }`)~[S]_0 ~+~ {1} over {K_i }` [S]_0` ^2 }]     식(6)

효소 HRP와 기질 H2O2, PCP의 초기농도를 변화시키면서 일련의 실험을 진행하여 식(6)의 비선형 속도식에 대한 매개변수를 구하였는데 그 결과를 Table1에 나타내었다.

Table 1. Evaluation of kinetic parameters

Kcat(s-1)	Kma(mM)	Kmb(mM)	Ki(mM)
85	6.45	0.011	1.2

따라서  PCP와 HRP의 효소반응속도식은 다음과 같이 표현할 수 있다.

[eqn: V_0 ={85~[E]_0 ``[H_2 O_2 ]_0 ``[PCP]_0 } over { 6.45~[PCP]_0 ~+~ (`0.011` +`[PCP]_0`)`(`1`+` {[H_2 O_2 ]_0} over {1.2 })` [H_2 O_2 ]_0 }]         식(7)

이상에서 구한 속도식의 타당성을 확인하기 위하여 효소의 농도를 고정한 후 반응물의 초기농도를 변화시키면서 실험하였다. 그 결과 Fig.1과 Fig.2에 나타난 것과 같이 유도된 속도식이 실험결과를 잘 따르고 있음을 알 수 있었다. 한편, 효소의 농도가 높아질수록 실험데이타가 유도된 속도식으로부터 약간 벗어나는 것으로 나타났다(Fig.2).

다음은 PCP 산화반응의  최적조건을 찾기위해 온도와 pH를 변화시켜 실험하였다. 그 결과 Fig3과 Fig.4에 나타난 것과 같이 25℃, pH 6.5 일 때 산화반응에 의한 PCP의 제거율이 가장 높은 것으로 나타났다.

참고문헌

1. J.A.Nicell et al, Wat. Res., 27(11), 1629-1639 (1993)

2. Klibanov A.M., Science, 221, 259-261 (1983)

3. V.A.Cooper et al, Wat. Res., 30(4), 954-964 (1996)

4. J.A.Nicell et al, J. Chem. Tech. Biotechnol., 60, 203-215 (1994)