Phanerochaete chrysosporium을 이용한 Lignin Peroxidase

생산 최적 조건에 관한 연구

권혁민·최승인·정병철*·정욱진

명지대학교 화학공학과, 생명과학과*

A study on the Optimal Conditions for the Production of Lignin Peroxidase by Phanerochaete chrysosporium

Hyok-Min Kwon, Seung-In Choi, Byeong-Chol Jeong* ,

Wook-Jin Chung

Dept. of Chemical Engineering, Dept. of Biological Sciences*, MyongJi Univ.,

Yongin 449 - 728, Korea

서  론

Lignin Peroxidase(LiP)은 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠등의 방향족 난분해성화합물 및 목재성분중의 리그닌 물질을 분해할 수 있는 우수한 성능의 효소로 환경분야에서 이에대한 수요가 증대할것으로 기대되고있으나 국내외에서 상업적으로 전혀 생산이 안되며 또한 미생물을 이용한 효소생산에 대한 기초연구가 미비한 실정이다(1, 2). 본 연구에서는 LiP를 생산하는 백색부후균(P. chrysosporium) wild type과 mutant를 이용하여 각균주의 Growth kinetics와 LiP생산성과의 관계, 망간이온농도에 따른 세포외 효소들(LiP, MnP)간의 생산성 변화 및 배지성분내 첨가물질들(Surfactant, Veratryl alcohol, Buffer Solution)의 종류, 농도, 및 첨가시기에 따른 LiP 적정 생산조건을 규명하고자 실험하였다.

백색부후균은 목재성분중 리그닌물질을 분해할수있는 LiP효소를 생산하는 대표적 균주로 알려져 있으며 일반적으로 질소가 제한된 배지조건에서 대표적인 세포외로 생산되는 효소들인 lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP)등의 효소를 생산할수 있는 균주로 보고되었다(3).

P.chrysosporium의 ligninolytic enzymes(LiP, MnP)들은 대부분의 경우 질소영양분 제한조건하에서 발현이되기 때문에 그 결과로 low biomass와 bioenzyme 결과로 나타났다. 최근 일부연구그룹에 의한 lysine auxotroph 백색부후균은 nutrient-rich condition하에서 LiP생산성이 우수한 mutant균주를 개발한 결과를 발표하였으나 주로 enzyme regulation 기작과정 연구에 중점을 두고있다.  이에 본 연구에서는 wild type과 mutant균주들을 이용하여 cell growth kinetics, 배지내 조성성분에 따른 LiP 및 MnP 생산성 변화등을 조사하고자 하였다.  MnP효소는 대개의 경우 접종 3-4일후에 먼저 생성되고 이후에 LiP효소가 생성되는 것으로 보고되고 있으며 생산배지내 계면활성제 및 veratryl alcohol등의 첨가는 효소생산을 촉진하는 역할보다는 효소를 protect하여 효소의 activity에 밀접한 영향이 있는 것으로 보고 되고 있다. 또한 망간이온의 첨가는 LiP 활성도를 감소시키며, MnP 활성도를 선택적으로 증가시킨다. LiP 활성도는 MnII level이 낮을 때(0.3 to 1.6 ppm)에 나타나며, MnP는 MnII level이 높을 때(40 to 199ppm) 생성이 촉진되는 것으로 보고되는등 망간이온농도는 LiP 및 MnP 간의 생산성에 영향을 주고 있다(4).

실  험

균주 및 배양조건

균주는 Wild Type으로 생명공학연구소에서 분양받은 Phanerochaete chrysosporium BKM-F 1767 (ATCC 24725)을 사용하였으며 YMPG Agar slants에서 배양하였다. 또한 mutant lysine auxotroph PSBL-1은 미국에서 분양받았으며 3mM의 lysine이 함유된 YMPG Agar slants에서 유지하였다.  LiP 생산을 위하여 150rpm, 37℃ shaking incubator에 WT의 경우 nitrogen limited medium에서, PSBL-1은 non-limited medium조건하에 배양하였다 (5).

배지첨가성분

Buffer종류로써 DMS, Acetate, Sodium tartrate buffer를 0.1M의 농도로 Basal medium에 첨가하여 LiP 활성도와 MnP 활성도, pH를 측정하여 최적 buffer를 선택하였다.  Manganese ion의 영향을 보기 위해 MnSO4·H2O를 0, 12, 100ppm으로 각각 첨가하였으며 Veratryl alcohol(VA)의 경우 농도를 0, 0.4mM, 0.8mM이 되도록 첨가하여 배양한후 이에 따른 효소활성을 측정하였다. 계면활성제는 Tween 80(polyoxyethylene-sorbitan monoleate), Span 80(sorbitan monoleate)을 각각 0, 0.5 percent로 첨가하였다.

Enzyme assays

LiP의 활성도 측정은 H2O2존재하에 veratryl alcohol이 veratryl aldehyde로 산화되는 양을 UV spectrophotometer (Shimadzu)로 310nm 파장에서 측정하였으며, 측정용액은 25mM sodium tartrate (pH 2.5), 2mM veratryl alcohol, 0.4mM H2O2, 50에서 275□l의 배양용액으로 최종 부피가 4ml가 되도록 하여 25℃에서 측정하였다 (5).

MnP의 활성도측정은 Phenol red의 산화를 610nm에서 측정하였으며, 측정용액은 50mM sodium succinate (pH 4.5), 50mM sodium lactate (pH 4.5), 0.1 mM MnSO4, 3mg gelatin per ml, 50□M H2O2, 0.1 mM phenol red, 50 to 275□l의배양용액을 첨가하여 최종부피가 4ml가 되도록 하여 30℃에서 측정하였다 (5).

실험 결과 및 고찰

질소제한배지 조건하에 배양된 WT 균주의 경우 배양 6일째 약 1 liter당 34.7 unit의 LiP 효소를 최대 생산하였으며 이후 효소 생산성이 감소됨을 나타내었고 MnP는 배양 4일째 최대 61 U/L를 나타내었다. 초기에 MnP가 먼저 생성되고 이후 LiP가 생성되는 패턴은 WT 및 PSBL-1균주 모두에게 비슷한 경향을 나타내었다.  Buffer solutions(DMS, Acetate, Sodium tartrate)를 초기에 0.1M농도로 첨가였을 때 DMS buffer첨가시 LiP 활성도가 가장 높았으며 6일째에 37.4 U/L를 나타내었다 (Fig. 1). Nutrient rich condition하에 배양된 PSBL-1균주도 DMS buffer 첨가시 LiP 활성도가 가장 높았으며 6일째에 622 U/L를 나타내었다 (Fig. 2). PSBL-1균주의 경우 DMS Buffer가 Acetate보다 거의 LiP 활성도가 1.5배 증가함을 나타내었다. DMS, Acetate, Sodium tartrate 순으로 LiP 생산성이 증가하였으며 PSBL-1 균주의 경우 생산성 촉진 효과가 더욱 증대되었으나 DMS완충용액의 경우 비싼 가격으로 인하여 상업적 생산시 거의 비슷한 촉진효과를 나타내는 Acetate 완충용액을 사용해도 LiP 생산성이 거의 비슷함을 나타내었다. 또한, PSBL-1이 WT보다 LiP생산성이 거의 약 17배(622U/L)정도 높은 결과를 나타내었다.

그림3을 살펴보면 초기에 veratryl alcohol(VA)를 0, 0.4, 0.8mM 농도로 배지에 첨가하였을 때 0.4mM VA첨가시 LiP 생산성(37 U/L)이 가장 높았으며 첨가 안하였을 때는 LiP 활성도가 감소하여 28 U/L를 나타 내었다. VA는 백색부후균이 생산할 수 있는 이차대사물로 알려져있고 이 물질의 첨가시 LiP생산성을 촉진할 수 있다고 보고되었다. 적당량의 VA 첨가시 배지용액내에 생성된 H2O2와 반응하여 veratryl aldehyde로 산화됨으로써 H2O2로인한 효소활성도 저해효과를 감소시켜 LiP 활성도를 높이는 것으로 추측되어진다.

계면활성제(Tween 80, Span 80)를 0.5% 첨가시 Span 80는 WT 및 PSBL-1균주 모두 LiP 및 MnP 활성도를 감소시킨 반면, Tween 80의 경우 LiP의 활성도를 20%정도 증진시킴을 확인할 수 있었다 (Table 1). 자세한 기작작용은 결정되지 않았지만 일부 연구보고성에 의하면 균주의 plasma membrane의 permeability를 증가시켜 효소 생산성을 촉진시키거나 Tween 80의 균주가 생산하는 효소에 의해 지방산이 분해되어 균주가 생산하는 ligninase생산에 도움을 주어 LiP 생산성향상에 도움을 준 것으로 추측되고 있다 (6).

LiP 활성도는 MnSO4·H2O 농도(0, 12, 100 ppm)가 증가하면서 활성도가 감소하고 이와는 반대로 MnP는 MnSO4·H2O의 농도가 증가하면서 활성도도 증가함을나타내었다(Table 1). 망간이온 투입시 MnP 생산성을 증가 시킴과  반대로 LiP 생산을 감소시켰으며, 망간이가 이온은 MnP축적에 효과적임을 나타내었다 (7).

참고  문헌

. Bumpus, J. A.,and S. D. Aust. Bioessays 6:166-170, 1987.

. J. S. Yadav and C. A. Reddyt. Appl. Environ. Microbiol. 59:756-762. 1993.

3. S. W. Dhawale, S. S. Dhawale, and D. Dean-Ross. Appl. Env. Microbiol. 58:3000-3006. 1992.

4. P. Bonnarme and T. W. Jeffries. Appl. Env. Microb. 56:210-217. 1990.

5. A. B. Orth, M. Denny, and M. Tien. App. Environ. Microbiol. 57:2591-2596. 1991.

6. M. Asther and G. Corrieu. Enzyme Microb. Technol. 9:245-249. 1986.

7. M. H. Gold and M. Alic. Microbiol. Rev. 57:605-622. 1993.

Fig. 2. Extracellular LiP activity of P.chrysosporium PSBL-1 cultures under various buffer solutions : DMS (●), Acetate (▲), Sodium Tartrate (□) buffer

FIG. 1. Extracellular LiP activity of P.chrysosporium WT cultures under various buffer solutions : DMS (●), Acetate (▲), Sodium Tartrate (□) buffer

단위 : U/L

Strains Condition	WT (a)		PSBL-1 (b)
	LiP	MnP	LiP	MnP
medium without nutrient	37	0	622	1,241
MnSO4·H2O 12ppm	37	43	492	1,454
MnSO4·H2O 100ppm	26	57	317	1,681
0.5 % Tween 80	42	48	698	1,374
0.5 % Span 80	31	0	541	893

FIG. 3. Extracellular LiP activity of P.chrysosporium WT cultures under various conditions : non V.A (●), 0.4mM V.A(▲), 0.8mM V. A.(□)

TABLE 1. Maximum LiP and MnP activity of P.chrysosporium WT and PSBL-1 cultures under various nutrient conditions ( a: nitrogen limited, b : non-limited medium )