주목나무 추출물에서 액체 크로마토그래피를 이용한 Taxol의 분리

장경곤, 정용안, 박영광, 노경호, 정성택

인하대학교, 화학공학과

Separation of Taxol from Yew Extracts

by High-Performance Liquid Chromatography

Kyung Kon Chang, Yong An Jung, Young Kwang Park,

Kyung Ho Row, Sung Taik Chung

Dept. of Chem. Eng., Inha University

서론

Taxol은 주목나무에서 추출되는 taxane diterpene amide이다[1]. 이 자연 추출물은 백혈병의 치료제로 탁월한 성능을 가지고 있으며, 또한 자궁암, 유방암, 후두암 및 불치성 말라리아 등에 대해서도 효과가 있음이 임상학적 실험으로 증명되었다.[2]

현재 Taxol을 얻는 방법은 세가지가 있는데, 첫째는 주목나무 추출물에서의 분리하는 방법으로 현재 가장 많이 사용되고 있다.  둘째는 합성하는 방법인데Taxol의 복잡한 화학적 구조 때문에 큰 성과를 거두지 못하고 있으며 주목나무 추출물 중 전구체를 이용한 semi-synthesis가 이루어지고 있다. 셋째는 주목나무 배양액으로 부터의 분리인데 아직까지 경쟁력을 확보하지 못하고 있다.

현재까지의 연구는 Zorbax SW Taxane column(60Å, 10□ silica particles, bonded with a proprietary phase)을 사용하여, reversed phase는 methanol-water(65:35), normal phase는 heptane-isopropanol(60:40)의 mobile phase 조성하에서 taxol과 cephalomannine을 분리하였고[3], phenyl column(150×4.6mm)을 사용하여 reversed phase에서 acetonitrile-methanol-water의 mobile phase 조성을 바꿔가며[4], cyanopropyl column(250×2.1mm I.D.)을 사용하여 normal phase에서는 hexane-IPA의 mobile phase 조성을 변화시켜 가며 taxol을 분리하는 실험 등이 진행 되어 왔다[5].

본 연구의 목적은 주목나무의 추출물에서 taxol은 분리하기 위한 실험조건을 결정하는 것이다. Reversed phase column과 normal phase column을 사용하여 water, methanol, acetonitrile은 reversed phase을 이동상으로 사용하였고 hexane, 1-propanol, IPA, methanol, ethanol은 normal phase의 이동상으로서 solvent의 종류와 조성에 따라서 taxol을 분리하기 위한 최적조건을 구하고자 한다.

실험

1. Extraction과 Concentration

추출은 임목육종연구소에서 제공한 주목나무 powder(건량기준 10g)에 메탄     올 1□로 24시간이상 실시하였다. 추출이 끝난 extracts 125□에 chloroform     100□와 water 100□를 혼합하여 30분간 교반하고 분별 깔대기로 2시간에서     14시간정도 침강시켰다. 이 공정을 두 번 반복하여 실시한 후 bottom           layer(100□)를 채취하여  rotary evaporator (LABO-THERM SW 200,         Resona Technics Co.)에서 syrup이 될 때까지 농축한다. 이 syrup에 다시       메탄올을 가하여 5,000ppm 시료를 만든다.

2. Separation과 Chromatography

본 실험에 사용된 standard(10-deacetylbaccatin, 7-epi-10-deacetylbaccatin     Ⅲ, baccatin Ⅲ, 7-epi-10-deacetyltaxol, cephalomannine, 10-deacetyltaxol,      taxol)는 NCI(the National Cancer Institute. Bethesda, MP, USA)에서 제공하    였고, 추출한 시료를 injection volume 10□, flow rate 1□/min,                 UV-wavelength 228nm에서 reversed phase는 water-acetonitrile-methanol,     normal phase는 hexane-normal propanol-IPA-methanol-ethanol의 mobile      phase의 조성을 바꿔가며 분리 실험을 진행하였다.

실험에 사용된 장치는 reversed phase 경우 pump(Model 2326-26, TSP),       U6K injector(2□ sample loop), 3,000psi까지 측정 가능한 pressure             gauge(Span instrumant Co.) 등으로 구성되어 있고, 시료 검출은               Absorbance Detector(M720, Young In Co.)를 사용하였으며, column은          Curosil-PFP와 YMC ODS가 충진된 column을 사용하였다.(참조 Table 1)

Normal phase의 경우 HPLC는 Waters사의 600E pump(multisolvent           delivery system), 486 detector(UV-visible tunable wavelength absorbance),    U6K injector(2□ sample loop)를 사용하였고, data acquisition system은        CHROMATE(v.2.1, Interface Eng.)를 PC에 설치하여 사용하였다. 본 실험에    서 column은 Nova-Pak Silica를 사용하였다.

Table 1. Specifications of the columns used in this experimental

	dimemsion (length×I.D.)	particle size	pore size	Supplier
Curosil-PFP	250×4.6mm	5□	-	Phenomenex
ODS	250×4.6mm	40∼63□	120Å	YMC
Nova-Pak Silica	150×3.9mm	4□	60Å	Waters

결과 및 고찰

Reversed phase와 normal phase column에서 solvent의 polarity를 변화시키면서 관심있는 taxol을 분리하는 경우 실험결과는 다음과 같다.

Fig. 1은 Curosil-PFP column에서 NCI에서 제공한 7개의 standard sample을 분리한 chromatogram이다. 사용된 mobile phase 조성은 acetonitrile과 water를 25:75(v/v,%)로 시작하여 40분동안 조성을 65:35(v/v,%)가 되게 gradient 방법을 사용하였다. 이러한 실험조건으로 분석용 column에서 yew extract의 주성분들이 완전히 40분내에 분리되었다.

Fig. 2는 제조용 packing인 ODS column에서 주목나무 추출물(extract)에 대한  chromatogram이다. 사용된 mobile phase 조성은 acetonitrile과 water를 50:50(v/v,%)으로 isocratic method로 유량은 1□/min로 하였다. 그림에서 보는바와 같이 taxol 및 부근의 두 물질 10-deacetyltaxol, cephalomannine가 co-elute하였다. 이를 분리하기 위한 mobile phase의 polarity 변화, gradient method, chemical buffer 사용등이 고려 될 것이다.

Normal phase에서 taxol, 10-deacetyltaxol, cephalomannine 각각 100ppm 용액을 혼합한 standard mixture의 chromatogram이 Fig. 3에서 보여주고 있다. 사용된 mobile phase 조성은 hexane, 1-propanol과 methanol를 96:2:2(v/v,%)로서 isocratic method로 유량은 1□/min로 하였다. 여러 연구결과에 의하면 reversed phase HPLC가 normal phase HPLC보다 taxol분리에 유리하다고 보고하고 있지만 본 연구에서는 normal phase HPLC의 분리 가능성을 검토하였다. 이상에서의 실험결과는 향후 제조용 HPLC에 응용될 것이다.

감사

본 연구는 교육부 생물화학공학 분야 연구과제로 수행 중인 project입니다. 연구가 원할하게 진행될 수 있게 standard를 제공해 주신 NCI와 주목나무 powder를 제공해 주신 임목육종연구소에 감사를 표합니다.

참고문헌

1. M.C. Wani, H.L. Taylor, M.E. Wall, P. Coggon and A.T. McPhail, J.          Am. Chem. Soc., 93(1971) 2325

2. C.C. King and A. Belinda, J. Chromatogr. B., 657(1994) 301-306

3. D.R. Wu, K. Lohse and H.C. Greenblatt, J. Chromatogr. A., 702(1995) 234

4. T.P. Castor and T.A. Tyler, J. Liq. Chromatogr., 16(3) 1993 724

5. J. H. Cardellina Ⅱ, J. Liq. Chromatogr., 14(4) 1991 661