실리콘 재질의 Micro-PCR칩과 열전소자를 이용한 온도제어장치를 통한 빠른 DNA 증폭

이중석*, 김욱은1, 최재순, 윤성욱, 한상엽, 김현정

㈜바이오메드랩, 서울대학교 대학원 협동과정 의용생체공학 전공1

jslee@bio.bmelab.co.kr

Rapid DNA Amplification on Silicon Based Micro-PCR Chip Controlled by Designed Thermal Cycling System

Joongseok Lee*, Wookeun Kim1, Jaesoon Choi, Sungwook Yoon, Sangyup Han, Hyunjung Kim

Biomedlab, Co., Department of Biomedical Engineering, Seoul National University1

jslee@bio.bmelab.co.kr

서론

Polymerase Chain Reaction(PCR)은 생체 시료 내에 있는 소량의 DNA나 RNA를 분석이 가능한 수준의 양으로 증폭시켜주는, 일종의 화학적-열적 과정이다. 현재 생물 분야에서 PCR은 비교적 필수적인 과정 중에 하나가 되었으나,  전체 과정에 소요되는 시간이 상당할 뿐만 아니라, 증폭하는데 필요한 각종 시료의 소비도 많다는 문제점이 있다. 이에, 보다 빠른 시간에 소량의 샘플 및 시료를 사용하여 PCR을 수행하기위한 일련의 노력을 Micro-PCR이라 한다. 이 연구에서는 적은 용량의 샘플 및 시료에 대해서 빠른 시간 내에 PCR을 수행할 수 있는 Micro-PCR 칩과 온도제어시스템을 개발 하였다. Micro-PCR 칩은 실리콘웨이퍼 위에 MEMS 공정을 통하여 제작되었으며 내부 반응 챔버의 부피는 5㎕이다. 온도제어장치(thermal cycling system)는 하나의 소자로 가열과 냉각을 시킬 수 있는 열전소자를 바탕으로 PID 제어를 수행하며, 평균 온도변화율은 10℃/sec(최고 15/sec)이고, PCR의 각 온도 단계에서 유지되는 온도정확도는 ±0.1℃/sec의 성능을 발휘하였다. 실험 결과, 5㎕의 용량에 대해서 15분 내에 PCR을 수행하여 target DNA의 증폭을 확인하였다. 이러한 Micro-PCR은 현재 PCR 과정의 단점을 극복할 수 있을 뿐만 아니라, 향후 모든 생화학적 과정을 작은 칩 안에서 자동으로 일어나게 하는 랩온어칩(lab on a chip)의 부분 기술로서도 큰 의미가 있다.

설계 및 제작

1.Micro-PCR 칩

Micro-PCR 칩은 열전도가 좋은 실리콘 웨이퍼 위에  MEMS공정을 통해 제작하였다. 세부적으로는, 실리콘 웨이퍼를 TMAH 20% 용액 속에서 95℃의 온도로 반응 챔버와 채널을 wet etching 한 후, 생물학적으로 안정화 시키기 위해서 SiO2로 코팅하였다. Micro-PCR 칩의 위판은  Schott Borofloat 유리를 재료로 샘플 주입구와 배출구가 만들어져 있으며, anodic bonding을 통해서 아래판과 접합되었다.[그림1]  전체적으로는 공기압으로 반응 시료를 주입하고 배출  시키는데 용이하도록 설계 되었으며,  특히, 반응 챔버 가장자리의 구조물들은 Micro-PCR 칩 의 반응 챔버 내로 반응 시료를 보다 균일하게 주입하고, 일관되게 수거하기 위해서 제작되었다. PCR 과정이 일어나는 반응 챔버의 크기는 폭 5.2㎜, 높이 200 ㎛이고, 반응 시료가 이동하는 채널의 폭은 최대 100㎛, 최소 50㎛ 이다.

(a)

(b)

[그림1] Micro-PCR칩 모습 (a) Micro-PCR칩 전체 모습. 주입구와 배출구, 채널, 반응 챔버 (b) 반응시료의 주입 및 수거를 용이하게 하기 위한 범퍼(bumper) 챔버와 주입부 채널

2. 온도 제어 장치 (Thermal cycling system)

온도 제어 장치는 Micro-PCR 칩을 가열/냉각하기 위해서 설계, 제작 되었다. 가열과 냉각이 따로 수행될 경우, 그 성능은 다양화 시킬 수 있지만, 장치 자체가 커지기 때문에 이 연구에서는 두 가지 기능을 하나의 소자에서 수행할 수 있는 열전소자(model #TK 06127, Thermotek, Co., Korea)를 사용하였다. 즉, 열전소자에 가해주는 전류의 방향을 바꾸어줌으로써 Micro-PCR 칩과 접촉해 있는 열전소자면의 역할을 가열/냉각으로 바꾸게 된다. 이 연구에서는 56.1W 용량의 열전소자를 최대 용량으로 사용하였다. 그 결과, PCR 각 온도 구간사이의 온도 변화율은 평균 10℃/sec, 최대 15℃/sec의 성능을 발휘하였다. PCR을 위한 온도 장치에 있어서 중요한 점은 각 단계 사이의 온도변화율 뿐만 아니라, 특정 온도에서의 온도 유지율도 포함된다.  따라서, 제어가 특히 중요하다. 이 연구에서는 PID 제어 방법을 이용하였다. Micro-PCR 칩의 온도를 측정한 후에 PCR 온도 곡선의 설정값과 비교하고, 그 오차 값만큼을 보상하기 위해 전류의 양과 방향을 변화시킨다. 이때, 설정된 PCR 온도 설정 곡선의 성향에 따라서 제어 수행이 영향을 받게 되는데, 예를 들어, PCR 각 온도 구간 사이를 단위 함수와 같이 설정하게 되면, 제어 시에 갑작스런 오차 값의 증가로 overshoot나 undershoot이 발생하게 된다. 이러한 현상은 실제 PCR의 결과에 매우 치명적인 영향을 끼치게 된다. 따라서, 우리는 이 문제를 해결하기 위해서 PCR 각 온도 구간 사이를 지수함수를 이용하여 설정하였다.[그림2] 그림2.의 A점과 B점을 보면 설정 값의 갑작스런 변화가 일어나는 것을 지수함수를 통해서 개선하였음을 알 수 있다. 그 결과, overshoot과 undershoot을 줄일 수 있었으며, 특정 구간을 제외하고는 설정온도에 대한 유지율은  ±0.1℃/sec까지 제어되었다.

실험

실험을 위해서 사용된 DNA는 베타-글로빈(beta-globin)이고, 상업용 PCR 기계를 통해서 대조군을 만들었다. 실험에 있어서, Micro-PCR 칩의 표면을 코팅해 줄 필요가 있는데, 이는 이미 코팅된 실리콘 재질의 반응 챔버 및 채널  뿐만 아니라, 반응 시료와 접촉하는 위판의 유리 웨이퍼에 DNA나 효소(Taq polymerase)의 흡착을 방지하기 위한 목적이다. 실험에서는 Bovine Serum Albumin(BSA)를 이용하였는데, BSA의 농도 및 코팅시간이 실험의 변수로 작용한다. 뿐만 아니라,  온도 제어 장치 위에서 수행되는 Micro-PCR의 각 단계( denaturation - annealing - extension)의 온도와 유지시간 등도 변수가 된다. 실험 과정에서는 Micro-PCR 칩 내/외로 공압을 이용하여 5㎕의 반응 시료를 주입/수거 하였고, 반응 중에는 silicon rubber를 이용하여   Micro- PCR 칩의 주입구와 배출구를 차단하였다.

A

B

[그림2] 온도 제어 장치를 통해서 Micro-PCR을 수행했을 때의 온도 곡선. (파란색: 설정온도, 빨간색: Micro-PCR 칩 표면 온도)

결과 및 토론

온도 제어 장치 위에서 가열/냉각이 반복되는 Micro-PCR 칩 내에서 시행된 PCR은 여러 변수에 의해 반복 실험 되었고, 그 결과 target DNA인 베타-글로빈의 증폭을 확인하였다. 기존의 상용 PCR 기계를 통한 대조군은 50㎕의 반응 시료에 대해서 2시간의 반응 시간이 걸렸고, Micro-PCR 칩과 온도 제어 장치를 이용한  이번 실험은 5㎕의 반응 시료에 대해서 15분만에 DNA 증폭에 성공하였다. 또한, BSA를 이용한 Micro-PCR 칩의 반응 챔버 표면 코팅의 조건에 따라서 DNA 증폭의 정도가 다르게 나타났다.

Micro-PCR 증폭 실험은 각각의 실험 변수에 대해서 반복하여 실시하였으며,  설정된 실험 변수를 제외한 다른 조건들을 가능한 동일하게 하도록 유의하였다. 증폭 여부 확인은 Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용하였으며, 그림3.의 이미지는 Agilent 2100 Bioanalyzer에서 출력된 gel running 사진이다.

L   ( +)    1   2   3   4   5  6   7

[그림3] Micro-PCR칩과 온도제어장치를 이용한 DNA 증폭 실험 결과.

(L:ladder, (+):상용 PCR 기계를 통한 positive control, 1~7: Micro-PCR 반복 실험 결과)

beta-globin

Micro-PCR의 각 단계별 시간 및 온도 변화 실험에서는 각 단계의 시간을 5초까지 감소시킬 수 있었으며, 각 단계의 온도 간에 이동시간이 있기 때문에, 결국 한 사이클을 수행할 때 30초의 시간이 걸렸다. 결국, 15분 만에  DNA 증폭이 완료 되었다.

Micro-PCR 칩과 빠르고 정확한 온도 제어장치를 이용한 Micro-PCR 실험은 기존의 방법에 비해서 적은 양의 반응시료를 이용하여, 빠르게 PCR 과정을 수행 할 수 있다는 장점이 있고, 장치의 소형화에도 큰 도움을 줄 수도 있다. 뿐만 아니라, 향후 랩온어칩의 개발에 있어서 중요 기술로서 인식될 수 있다.

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