Dextran Microsphere의 제조 및 특성에 관한 연구

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

조정모, 강춘형

전남대학교 화학공학과, 고분자기술연구소

A Study on Preparation and Properties

of Dextran Microsphere

Joung-Mo Cho, Choon-Hyoung Kang

Department of Chemical Engineering, Polymer Science and Technology

Research Center, Chonnam National University

서론

Hydrogel은 일반적으로 친수성 고분자의 가교를 통해 제조되며, 3차원적 입체 구조를 유지하고 스스로 물에 녹지 않지만 과량의 물에 접촉하게 할 때 매우 빠르게 팽윤하는 특성을 갖는 물질을 말한다. Hydrogel의 제조에 사용되는 고분자로는 자연고분자 뿐만 아니라 친수성 합성 고분자 또한 원료가 될 수 있으며, 이것이 갖는 특성은 원료 고분자의 분자량 분포, 친수도, 그리고 가교밀도 등에 따라 변할 수 있다. 또 제조된 hydrogel은 다량의 물을 함유하고 있어서 생물학적 친화성을 갖게 되며, 이와 더불어 외부환경에 대한 민감성, 조절 가능한 투과도 등의 이유로 의료, 약학, 생화학 및 그 외 많은 산업분야에 널리 응용되고 있다. 또한 이와 관련한 많은 연구에 있어서는 용질의 회수, 막분리, GPC의 고정상, 약물 방출 시스템 등을 취급하고 있다.

Microsphere는 물과 같은 용매에 의해 팽윤되는 가교된 작은 구형 입자의 hydrogel을 말하며, 이것의 제조에 가장 널리 사용되는 방법 중 하나가 두 상 고분자 용액(ATPS) 에멀젼을 이용한 방법이다. ATPS는 서로 융화되지 않는 두 종류의 고분자들이 일정 농도 이상으로 물에 가해졌을 때 형성되는 두 액상을 말하며, ATPS용액을  강렬하게 교반하면 에멀젼이 생성되고, 여기에 자유 라디칼 개시제를 첨가하여 가교를 시켰을 때 microsphere가 생성된다. 이러한 방법은 크기의 조절, 좁은 크기 분포, 빠른 시간 내 입자 핵화, 용질의 봉입(encapsulation)의 용이성 등과 같은 장점을 가지고 있다. ATPS 에멀젼을 이용하여 microsphere를 제조하기 위해서는 상평형 도표에 대한 정보가 필수적이며 이는 상분리 실험을 통해 결정될 수 있다.

본 연구의 목적은 microsphere를 제조하고, 이것의 제조에 미치는 영향과 특성에 대해 알아보는 것이다. 먼저, dex를 가교하기 위해 MA 그룹의 직접적인 치환을 유도하는 transesterification 반응을 통해 dex-MA를 제조하였다. 1H NMR, 13C NMR, FT-IR, 그리고 GPC를 통해 MA 그룹의 치환을 정량, 및 정성적으로 확인하였으며,  DS를 달리하는 dex-MA, PEG, 그리고 물로 구성된  ATPS용액의 상평형도표를 결정하였다. 이로부터, DS가 다른 dex-MA를 사용하여 water-in-water 에멀젼을 형성하고, 이로부터 dex-MA의 가교를 통해 microsphere가 얻어질 수 있었다.

실험

DMSO, KPS는 Kanto Chemical Co., TEMED, GMA는 Junsei Chemical Co., DMAP는 Avocado Research Chemicals로부터 각각 구입하였으며, 더 이상의 정제과정이나 변형없이 사용하였다. 물은 Milli-Q RG system을 사용하여 전도도가 18□이상으로 유지되는 2차 증류수를 사용하였다. 고분자로써 PEG 8,000(Lot# 86H1342)과 Dex 509,500(Lot# 29H1087)은 SIGMA Chemical Co.로부터 공급 받아 사용하였고, 이들 각각의 수평균 및 질량평균 분자량은 GPC를 사용하여 결정하였으며, 고분자의 분자량을 보정하기 위해 PEG 표준시료(WAT035711, Waters Co.)와 dextran 표준시료(Fluka)를 사용하였다.

Dex-MA의 표준 제조과정은 van Dijk-Wolthuis 등의 방법[1]을 따랐다. 무게를 측정한 dex와 DMSO를 DMAP와 함께 질소분위기 하에서 강렬하게 교반하여 dex를 완전하게 녹인 후, 계산된 양의 GMA를 첨가하여 반응을 시작하였다. DS의 조절을 위해 첨가한 GMA는 다음의 식을 이용하여 계산하였다.

[eqn: rm (GMA~질량) =& {(GMA~분자량)}over{(dex의~단위체~당~질량)} rm times (dex~질량) times DS over 100]	(1)

생성된 반응물을 투석을 통해 불순물을 제거한 후 투석튜브 내에 남은 잔류 용액은 동결건조기(Uni Trap Model 10-100)를 사용하여 건조하여 dex-MA를 얻었다. 제조된 각각의 dex-MA는 1H-NMR, 13C-NMR, FT-IR, 그리고 GPC를 사용하여 MA그룹의 직접적 치환을 확인하였다.

Dextran-based hydrogel은 dex-MA를 가교하여 제조하였다. 개시제와 가속제로써 각각 KPS와 TEMED를 사용하였으며, 겔화가 이루어졌을 때 결과적으로 생성된 hydrogel을 흐르는 물로 세척하였으며, 일부는 동결 건조하여 준비하였다. 또, 동결된 hydrogel은  FT-IR spectrum을 사용하여 그 특성을 관찰하였다.

앞에서 제조한 겔(1□ 직경)을 대략 1□ 길이로 자른 후, 과량의 물에 의해  평형상태로 팽윤된 것과 건조시킨 것을 각각 팽윤실험에 사용하였다. 팽윤 실험은 중량법(gravimetric method)과 blue-dex 용액법의 두가지 방법을 동시에 사용하여 각각의 방법에 대한 유효성을 확인할 수 있었다. 중량법에서는 충분한 시간 동안 물과 접촉하여 평형상태로 팽윤된 hydrogel의 표면에 존재하는 과잉의 물을 blotting에 의해 제거하여 즉시 무게를 재고  시간에 따른 무게의 변화로부터 팽윤비를 결정할 수 있었다. 한편, blue-dex 용액법은  농도의 변화에 따른 blue-dex의 푸른 색조의 변화를 UV로 측정하여 팽윤비를 간접적으로 얻을 수 있는 방법이다. Blue-dex의 수용액은 612nm에서 최대흡수파장([eqn: lambda_max])을 갖기 때문에 612nm 근처 5개의 투과도에 대한 평균값을 이용하여 농도를 보정하였다. 시간에 따른 팽윤비를 조사하기 위해 연속 팽윤 실험을 행하였다.

제조된 dex-MA로부터 PEG/dex-MA/물 계에 대한 상평형 도표를 결정하기 위해 상분리 영역 내의 고분자 조성을 갖는 혼합물을 제조하여 vial병에 담아 격렬하게 교반한 후 25℃로 유지되는 항온조 속에 5일 이상 방치하여 두 상으로 분리하였다. 분리된 각 상의 시료는 syringe를 이용하여 매우 조심스럽게 채취하였다. 채취된 시료를 정량적으로 희석한 후 평형조성을 결정하기 위해 microsyringe를 이용하여 20□를 GPC에 주입하였다.

Microsphere를 제조하기 위해, 먼저 dex-MA와 PEG로 구성된 두 상 영역 내 ATPS 용액(5□, 0.22M potassium chloride and 10mM phosphate buffer, pH 8.0)을 제조한 후 10분 가량 N2를 불어 넣어 용존되어 있는 산소를 제거하였다. 이를 2분 가량 격렬하게 교반하여 에멀젼화 되도록 하여 1∼10분 동안 안정화시켰다. 그런 다음 dex-MA를 가교하기 위해 TEMED(100□, 20 vol.%, adjusted to pH 7 with 4M HCl)와 KPS(200□, 50 □/□)를 가한 용액을 37℃로 유지되는 항온조에 30분간 방치하였다. 결과로써 생성된 가교된 입자는 원심분리와 세척액(증류수) 교환의 반복과정을 통해 불순물을 제거하였으며, 냉동건조를 통해 흰색 분말의 microsphere를 얻을 수 있었다. 완전하게 동결건조된 microsphere를 탄소 스티커에 뿌리고 금으로 코팅한 후, 2차 전자 이미지를 SEM(JEOL, JSM-5400)으로 관찰하였다.

한편, microsphere의 입자 크기 분포는 45□-(또는 100□-, 300□-)의 focal length를 갖는 렌즈가 부착된 입도분석기(PSA; Malvern)를 사용하여 측정하였다. 배경용매로는 2차 증류된 물을 사용하였고, 분석이 일어나는 동안 초음파를 주사하여 입자들간의 고착을 방지하였다.

결과 및 고찰

Dex-MA는 van Dijk-Wolthuis 등[1]의 방법을 사용하여 제조하였다. 이 방법에서는 dex와 GMA가 극성 용매인 DMSO내에서 반응이 진행되며 DMAP는 염기성 촉매로써 dex의 OH 그룹을 극성화한 후 MA 그룹의 직접적 치환을 유도하는 transesterification 반응을 통해 dex-MA를 제조하게 된다. 또한 반응의 결과로써 dex-GMA가 생성되지 않음을 설명한 바 있다[2].

생성된 dex-MA는 1H-NMR, 13C-NMR, FT-IR, 그리고 GPC를 사용하여 MA그룹의 직접적 치환을 확인할 수 있었다. 한편, 생성된 dex-MA의 DS는 정량적인 해석을 통해 얻을 수 있었으며, 이는 1H-NMR 분석에 있어서 이중결합에서의 피크 적분의 평균값과  5.30ppm(□-1,3 결합)을 포함한  4.96, 4.97ppm(anomeric proton)에 대한 피크 적분의 비교를 통해 구할 수 있었다. 이를 다음 식과 같이 나타낼 수 있다.

[eqn: {rm DS} = {(I_d +I_{d` prime})/2}over{I_a + f_alpha-1,3 I_a}]	(2)

물질수지를 기초로 한 이론적 DS(1식)와 NMR에 의한 계산된 DS(2식)를 비교하였을 때, 반응 전 첨가한 GMA는 NMR분석을 통해 계산된 DS값과 잘 비례하고 있음을 알 수 있었다.

25℃에서 dex(또는 dex-MA)/PEG/물 계에 대한 상평형 도표를 결정하였으며, 일반적으로 잘 알려져 있듯이[3] 각각의 고분자는 예외없이 해당하는 각 상에 높은 농도로 농축됨을 알 수 있었다. PEG의 대부분은 위상에 dex(또는 dex-MA)의 대부분은 아래상으로 농축되었다. 구성 고분자의 분자량이 증가하면 농축된 정도가 증가하여 binodal curve의 저농도 영역으로 이동하는 일반적인 개념과 상반되게 dex-MA의 DS가 증가함에 따라 binodal curve가 고농도 영역으로 이동하는 것은 주목할 만한 결과이다.  또, 고정된 feed의 조성에 대해 DS에 따른 tie line length(TLL)의 변화를 고려해볼 때, DS가 증가함에 따라 TLL이 감소하는 것은 OH 그룹이 MA 그룹으로 치환됨에 따라 상분리 영역이 축소됨을 의미한다. 여기서, TLL의 물리적 의미는 각 평형상이 임계점으로부터 떨어진 거리를 나타내며 아래의 식에 의해 계산하였다.

[eqn: rm TLL &= SQRT{ left[(Wt.%)_"bottom"^PEG - (Wt.%)_"top"^PEG right]^2 rm + left[(Wt.%)_"bottom"^dex-MA - (Wt.%)_"top"^dex-MA right]^2}]	(3)

Dextran-based hydrogel의 중요한 특성 중 하나는 팽윤 성질이다. 본 연구에서는 팽윤비를 결정하기 위해 질량법과 blue-dex 용액법 등 두가지 방법을 사용하였다. 질량법에서는, 팽윤된 겔이 일정온도에서 건조되는 반면, blue-dex 용액법에서는 건조된 겔을 첨가하여 팽윤하는 방법이다. Blue-dex 용액법은 간접적 방법으로써, blue-dex 내의 푸른 색조를 UV로 측정하여 팽윤비를 결정하는 방법이다. Blue-dex는 근본적으로 dex로부터 제조되었기 때문에 hydrogel로 흡수되지 않고 이와 상호작용이 존재하지 않음을 문헌[4]과 실험을 통해 알 수 있었다. 건조된 hydrogel이 blue-dex용액과 접촉하게 되면, 물의 흡수가 일어나고 이는 blue-dex용액의 농도 증가를 초래한다. 이러한 원리를 이용하여 팽윤비를 결정할 수 있었다. Hydrogel이 물과 접촉하였을 때 40분 이내의 빠른 팽윤이 일어나고 있음을 알 수 있었다. 또한 팽윤된 hydrogel은 건조된 hydrogel의 10∼20배에 달하는 많은 양의 물을 함유할 수 있으며, DS가 큰 hydrogel이 더 큰 값의 팽윤비를 나타냄을 알 수 있었다.

본 연구에서는 ATPS 에멀젼으로부터 그 용액 내에 존재하는 dex-MA의 가교를 통해 microsphere을 제조하였다. dex-MA의 농도가 microsphere의 제조에 미치는 영향에 대해 알아보기 위해 동일 tie-line 선상에 존재하지만 feed의 조성이 다른 ATPS 에멀젼을 사용하여 microsphere를 제조하였다. 가교반응 후 ATPS내의 에멀젼화 제로 사용된 PEG는 다중 세척을 통해 배제하여 dextran-based microsphere를 제조할 수 있었다.

Fig. 1은 microsphere에 대한 전형적인 SEM 사진을 나타낸 것이다. 두 사진 모두에서 확인할 수 있듯이 완벽한 구모양을 갖고 있으며, 크기가 어느 정도 균일한 microsphere가 제조되었음을 알 수 있었다. 또한 dex-MA의 DS나 크기에 상관없이 microsphere의 표면이 비다공성임을 확인할 수 있었다.

제조된 microsphere의 체적평균직경과 입자 크기 분포는 PSA분석을 통해 이루어졌으며, 이를 Fig. 2과 3에 나타내었다. Dex-MA의 feed 농도가 증가함에 따라 보다 큰 microsphere가 얻어졌으며, 정규분포의 경향에서 벗어나 넓은 입자 분포를 나타냄을 알 수 있었다. Dex-MA의 농도가 2.0 wt. % 이상으로 높아졌을 때는 ATPS의 점도가 크게 증가하고, 이는 불안정한 에멀젼의 형성을 초래하였다. 이러한 용액에 대한 가교반응은 구모양의 microsphere의 형성보다는 비대칭성 microsphere 혹은 고형 hydrogel이 생성되었다.

Fig. . SEM photographs of microspheres for (a) DS = 10, TLL = 20.6

and (b) DS = 20, TLL = 18.7 of 1.0 wt.% dex-MA composition.

Fig. 2. Particle size distributions of microspheres

for (a) 0.7 wt.%, (b) 1.0 wt.%, (c) 2.0 wt.%

of dex-MA(DS = 10) on TLL = 20.6.

Fig. 3. Particle size distributions of microspheres

for (a) 0.7 wt.%, (b) 1.0 wt.%, (c) 2.0 wt.%

of dex-MA(DS = 20) on TLL = 18.7.

참고문헌

1. W.N.E. van Dijk-Wolthuis, O. Franssen, H. Talsma, M.J. van Steenbergen, J.J. Kettenes-van den Bosch and W.E. Hennink, Macromolecules, 28, 6317-6322(1995).

2. W.N.E. van Dijk-Wolthuis, J.J. Kettenes-van den Bosch, A. van der Kerk-van Hoof, and W.E. Hennink, Macromolecules, 30, 3411-3413(1997).

3. J.M. Cho, and C.H. Kang, J. Res. Inst. Catal., 21, 105-114(2000).

4. O. Franssen, and W.E. Hennink, Int. J. Pharm. 168, 1-7(1998).