Saccharomyces cerevisiae를 이용한 ceramide(Ⅲ)의 최적 생산 조건 확립

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

김세경, 여미순*, 노경호*, 윤현식

인하대학교 생물공학과, 화학공학과*, 초정밀분리기술센터*

Optimization of Ceramide(Ⅲ) Production from Saccharomyces cerevisiae

Se Kyung Kim, Mi Soon Yeo*, Kyung Ho Row*, Hyun Shik Yun

Dept. of Bio. Eng., Dept. of Chem. Eng.*, Inha University,

Center for Advanced Bioseparation Technology* Inchon 402-751, Korea

서론

사람의 피부는 성인 여자의 경우 평균 3 kg, 남자의 경우 5 kg이나 되는 인체의 여러 기관 가운데 가장 큰 기관이라고 할 수 있다. 피부의 구조는 기저층으로부터 각화세포의 분화에 따라 epidermis, dermis, subcutaneous tissue로 분류된다. Epidermis의 최상층은 stratum corneum이라 불리며, 구성하고 있는 세포들 사이는 lipid bilayer로 채워져 있다. 이 lipid bilayer의 기능은 수분의 증발을 막고 세포와 세포를 연결하는 역할을 하는 것이다. 이러한 lipid bilayer는 ceramide, free fatty acid, squalene, cholesterol로 이뤄져 있다. 이 중에서도 ceramide는 전체 지질의 43~46%를 차지하고 있는 가장 중요한 피부지질로서 알려지면서 근래에는 피부의 보습과 손상된 피부 보호 층의 복원 기능을 가진 기능성 화장품 원료로서 널리 사용되고 있다.[1]

Ceramide는 모든 sphingolipid의 기본구조를 이루고 있으며, 이 ceramide는 다시 sphingoid base라는 기본 골격에 지방산의 acyl chain이 amide bond를 통해 연결된 형태로서 sphingoid base의 종류와 결합되는 지방산의 길이와 종류에 따라 다양한 형태의 구조를 갖게된다.[2] Sphingolipid는 모든 생물의 membrane의 막 구조를 형성하는 성분으로서 중요한 역할을 할 뿐 아니라 free form으로 존재하는 sphingosine, phytosphingosine을 비롯한 sphingoid base 유도체들은 epidermis의 최상층인 stratum corneum에 분포하면서 미생물에 대한 항균작용을 하는 것으로 알려졌다.[3,4] 한편 최근에는 신호전이체계의 중간 신호전달물질로서 다양한 생물학적 기능이 밝혀지고 있으면서 sphingolipid의 응용 범위는 피부재생, 항염증치료 나아가 항암제 개발로까지 모색되기에 이르렀다.[3,4]

Ceramide 생산은 주로 동물성 원료에서 연구되고 있는데 얼마전의 광우병 파동 등의 영향으로 현재는 식물성 원료로 대체해 나가고 있다. 최근에는 yeast에서 생산하는 sphingolipids에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.[3] Yeast는 상대적으로 빠른 성장, 비유독성 그리고 발생적으로 조종될 수 있는 능력 때문에 ceramide의 생산을 위해 적합한 것으로 알려져 있다. 현재까지 생산되는 ceramide는 단지 두 종류의 yeast, Saccharomyces cerevisiae와 Torulopsis (Candida) utilis에서만 발견되고 있다.[5]

Yeast에 의한 ceramide의 생산 그리고 그 양에 대한 정량적인 실험결과를 얻기 위해서 정상 HPLC를 이용하여 실험하였다. Yeast ceramide는 배양조건에 따라서 구조가 변한다. 본 연구에서는 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 ceramide를 직접 생산하고, cell 생장조건을 변화시켜 생산량을 높게 하는 것이 연구의 목적이다.

실험방법

1. 균주 및 배양

본 연구에서 사용한 균주는 sphingolipid를 생성하는 것으로 알려진 Saccharomyces cerevisiae (KCCM 50515)이다. 균주 배양을 위한 배지는 YEPD medium으로 그 조성은 glucose, 20 g/L; bacto peptone, 20 g/L; yeast extract, 10 g/L 이었다. 배양 조건은 250 mL Erlenmeyer flask내에 배지 50 mL를 주입, 접종한 후 회전식 진탕 배양기를 사용하여 배양 실험을 수행하였다. 회전수는 200 rpm이었으며 배양 시간은 48시간이었다.

2. 배양 조건

Saccharomyces cerevisiae의 ceramide 생산에 적합한 배양조건을 알아보기 위해 온도와 pH를 변화시켜가며 실험을 수행하였다. 온도는 20□, 25□, 30□, 35□, 40□였고, pH는 온도별로 멸균전에 각각 4, 5, 6, 7, 8로 조절하였다.

3. Heat shock

Ceramide의 생산시 heat shock을 가하면 heat shock protein의 합성과 trehalose의 축적과 같은 반응으로 인하여 ceramide의 생산량이 증가된다.[6] 본 연구에서는 ceramide의 생산량을 증가를 위한 적합한 heat shock 조건 선택 실험을 수행하였다. 배양이 끝난 Saccharomyces cerevisiae를 40□로 온도를 올려 incubation하였다.

4. Lipid 회수

생성된 lipid는 원심분리 방법과 ultrasonification 방법을 이용하여 추출하였다. Saccharomyces cerevisiae를 배양한 후, 회수한 배양액을 10,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 배지성분을 제거하고, 증류수로 두 번 washing하여 균체만 채취하였다.

5. Lipid 추출

5 g (wet weight)의 yeast 균체에 20 mL chloroform-methanol (1:2, v/v) 용액을 첨가한 후 sonicator (IKA U200S)로 5분씩 세 번 sonication 하였다. sonication한 샘플은 0.2 □ RC filter (Sartorius)로 filtering 하였다. 여과되지 않고 남은 균체는 다시 50 mL의 chloroform-methanol (2:1, v/v) 용액을 첨가하여 상온에서 30분 동안 stirring 한 후 다시 filtering 하는 과정을 4번 반복하였다. 회수된 샘플용액은 solvent evaporation 하였다. Evaporation한 sample은 polar components와 non-lipid contaminants를 제거하기 위해 sample에 chloroform-methanol-water (8:4:3, v/v)를 첨가하여 층분리를 하였다.[5]

6. Ceramide의 분리, 정제

건조된 total lipid는 sphingolipid를 획득하기 위해 mild alkaline hydrolysis 방법을 수행하였다. 건조된 lipid sample을 methanol-carbon tetrachloride (5:1, v/v) 용액에 녹인 후 0.2M의 methanolic NaOH를 동량 첨가하여 상온에서 한 시간 동안 alkaline hydrolysis를 하였다. 그 후 0.8배의 증류수를 첨가하여 교반한 후 1M의 acetic acid로 중화시킨 후 unsaponified lipid를 chloroform으로 추출하였다.[5]

7. 정상 HPLC-ELSD

HPLC 시스템으로는 Waters 600s Multisolvent Delivery System이 부착된 Waters 616 liquid chromatography (Waters Associates, Milford, MA, U.S.A.), 그리고 Rheodyne injector (20 □ sample loop)가 사용되었다. 데이터 수집은 Millennium 32 (V. 3.05, Waters, U.S.A)가 PC에 install 되었다. ELSD (Alltech)의 drift temperature는 65□이며, N2 flow rate는 1.6 l/min이였다. 이동상으로는 클로로포름, 그리고 메탄올이 사용되었다. HPLC용 column (Licroprep Si 60 15 □, 3.9□150 □)은 진공 펌프를 이용하여 채웠다. 이동상의 유속은 1.0 ml/min으로 고정되었다.

결과 및 고찰

Ceramide의 원물질인 sphingolipid를 생산하는 yeast의 한 종류인 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 ceramide를 직접 생산하고 제조용 정상 HPLC-ELSD를 사용하여 ceramide의 존재여부를 확인하였다. 배양한 cell은 chloroform과 methanol을 이용하여 lipid를 추출하였고, 추출한 lipid 용액을 evaporation을 한 후 chloroform-methanol-water mixture로 층분리를 수행하여 lipid 용액에 들어있는 불순물을 제거하였다. 불순물을 제거한 lipid 용액에서 순도 높은 sphingolipid만을 분리하기 위해 mild alkaline hydrolysis 방법을 수행하였다. Lipid 추출물을 mild alkaline hydrolysis하면 neutral lipid와 glycerophospholipids는 hydrolysis되고 sphingolipid는 안정하므로 보다 높은 순도의 sphingolipid를 회수할 수 있다. 추출, 회수한 sphingolipid는 ACRODISC CR PTFE 0.45□로 filtering 한 후 HPLC로 분석하였다. 정상 HPLC의 분석에서 첨가제 메탄올의 조성은 분석을 시작할 때에 10 vol.%에서 3분까지 70 vol.%으로 변화시키면서 각각의 단계에서 선형적인 변화를 주었다. Saccharomyces cerevisiae가 생산하는 ceramide의 생산량을 늘리기 위해 cell 배양시 온도와 pH 조건을 변화시켜 배양 후 추출하여 분석하였고, 배양후 heat shock을 주어 heat stress에 의한 ceramide 생산량 변화를 알아보았다. Ceramide의 온도 변화는 20, 25, 30, 35, 40□로 하였고, pH는 4, 5, 6, 7, 8로 실험을 수행하였다. Heat stress에 의한 ceramide의 변화는 배양한 cell을 배양이 끝난 후에 40□로 incubation 하면서 온도변화를 주었다. 시간별로 추출 회수한 결과 40□에서 30분 반응시킨 cell보다 (Fig. 1) 40□에서 1시간 반응시킨 cell (Fig. 2)이 피크의 면적을 비교하는 방법으로 ceramide의 생산능을 보면 5.9배(면적기준)의 ceramide가 존재함을 알 수 있었다.

참고문헌

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

1. Bouwstra, J. A., Gooris, G. S., Dubbelaar, F. E. R., Weerheim, A. M., Ijzerman, A. P.

and Ponec, M.: J. Lipid Res., 39, 186 (1998)

2. Vicanova, J., Weerheim, A. M., Kempenaar, J. A. and Ponec, M.: Arch Dermatol. Res.,

291, 405 (1999)

3. Dickson, R. C. and Lester, R. L.: Biochimica et Biophysica Acta, 1426, 347 (1999)

4. Dickson, R. C. and Lester, R. L.: Biochimica et Biophysica Acta, 1238, 305 (1999)

5. Rupeic, J., Mesaric, M., and Maric, V., Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 583 (1998)

6. Wells, G. B., Dickson, R. C. and Lester, R. L.: The J. Biological. Chem., 243, 7235,  (1998)

Fig. 1 Chromatogram of ceramide production that stirred during 30 min after shifting the temperature from 20□ to 40□

Fig. 2  Chromatogram of ceramide production that stirred during 1 hr after shifting the temperature from 20□ to 40□