토끼 구강 점막세포 성장에 미치는 배지첨가물의 영향

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

윤문영, 박희정, 이두훈, 박정극, 서수원*

서울시 중구 필동 3가 동국대학교 화학공학과

서울시 강남구 일원동 50번지 성균관 대학교 의과대학 삼성 서울병원 의공학과*

Effect of medium supplement on the growth of rabbit oral mucosal cell

Moon-Young Yoon, Hee-Jung Park, Doo-Hoon Lee, Jung-Keug Park, Soo-Won Suh

Department of Chemical Engineering, Dongguk University, Seoul, Korea

Department of Biomedical Engineering, Samsung Medical Center, School of Medicine, Sungkyunkwan University, Seoul, Korea*

서론

구강외과 분야에서 구강내 악성종양을 제거하는것과 같은 구강내에 발생하는 광범위한 점막손상을 치료하기 위하여 피부 이식을  하는 것이 일반적인 일이다. 그러나 이러한 피부조직을 이식할 경우 피부 본래의 구조와 기능을 유지하기 때문에 점막조직과 본질적으로 매우 다르고 내피세포와 연결세포와의 상호작용 때문에 피부 자체의 특징을 그대로 유지한다. 그러므로 이렇게 이식된 피부조직은 hair를 성장시킬수도 있고 땀을 나게 할수도 있기 때문에 환자에게는 부적합 할 수 있다. 그러므로 점막 손상을 재생하기 위해서는 점막 조직을 이식하는 것이 이상적이라 할수 있다. 또한 난치성 기도질환 환자를 치료하기 위하여 인공기도 삽관물 이식이 필요한데 이런 인공기도를 제조할때 인공기도 내부를 본래의 기도와 마찬가지로 점막조직으로 이루어 져야 한다. 점막조직은 자가점막을 사용하는 것이 면역거부반응을 발생시키지 않기 때문에 가장 이상적인 방법인데 자기 신체 내에서 광범위한 점막조직을 떼어내는 것은 거의 불가능 하므로 이에대한 대안으로 본인의 구강에서 소량의 점막조직을 떼어낸 후 점막세포를 분리하여 in vitro에서 고속으로 증식시켜 3차원적인 인공점막조직을 제조하는 조직공학 기술을 사용하는 것이 가장 이상적인 방법이라 할수 있다.

3차원적인 인공점막을 제조하기 위해서는 조직공학적 기법을 이용하여 점막세포 일차배양과 고속 대량 배양에 대한 연구가 선행되어야 하기 때문에 본 연구에서는 인공점막 제조 및 인공기도 내부에 점막조직을 이식할 목적으로 흰색 가토 구강으로부터 분리한 점막 세포를 사용하여 일차배양과 세포 성장에 미치는 배지 첨가물에 대한 영향을 조사하여 보았다.

실험재료 및 방법

1. 세포 분리

흰색 가토로부터 일정한 크기의 구강점막조직을 떼어낸후 에탄올과 PBS(Phosphate buffered saline)완충용액에서 세척한후 진피부분을 가능한 모두 제거하고 Dispase 용액(2.4U/ml)에서 4℃에서 18시간 방치하여 진피로부터 점막층만을 분리하였다. 이 조직을 Chopping한후 0.05%Trypsine과 0.02% EDTA를 함유한 용액을 넣고 37℃에서 10분 효소분해를 한후 Pipetting을 여러번하여 Single Cell을 분리하였다.

2. 일차배양

무혈청의 Keratinocyte-SFM(K-SFM, Gibco BRL, Grand Islands, N.Y., USA)배지에 BPE(Bovine pituitary extract, Gibco BRL)를 50mg/L, EGF(Human recombinant epidermal growth factor, Gibco BRL)를 5.0□/L, Ca2+농도를 1.5mM로 맞추어 일차배양용 배지로 사용하였다. 이 조제된 배지를 T75-Flask에 10ml 넣고 가토 구강 점막 조직으로부터 회수한 세포를 접종하여 37℃로 맞춘 CO2 Incubator에서 배양하였고 배지는 2일에 한번씩 교환해주었다.

3. 세포 성장에 미치는 배지 첨가물의 영향

점막세포를 일차배양 한 후 70%정도 confluent하게 되었을때 0.05% Trypsine: 0.02% EDTA를 사용하여 세포를 회수한 후 접종량을 3700개/cm2 으로 하였다. 배지 첨가물의 영향을 조사하기 위하여 K-SFM Basal Medium에 BPE, EGF, FBS의 첨가 여부를 각각 달리하면서 비교하여 보았고, FBS(Fetal Bovine Serum) 농도의 영향을 조사하기 위하여 K-SFM Basal Medium에 혈청농도를 변화시켜가면서 점막세포의 성장을 분석하였다.

결과 및 고찰

1. 일차 배양

흰색 가토로부터 구강점막조직을 떼어낸후 점막층만을 분리하여 효소처리후 연속적인 Pipetting으로 약 2.0-3.0x 106/cm2 의 viable cell을 회수할수 있었고, 회수된 세포를 BPE 50mg/L, EGF 5.0□/L, Ca2+농도를 1.5mM로 맞춘 무혈청의 KSFM 배지를 10ml 함유한 T75-flask에 접종하여 37℃의 CO2 incubator에서 2일마다 배지를 교환해주면서 배양한 결과 약 4-5일만에 confluent 하게 성장하였다.

Fig. 1. Primary culture of rabbit oral mucosal cell (A:1day, B:2day, C:4day, D:8day)

2. 세포 성장에 미치는 배지 첨가물의 영향

점막세포 성장에 미치는 K-SFM 배지의 첨가물에 대한 영향을 조사하기 위하여 K-SFM Basal Medium을 대조구 로 사용하여 Ca2+과 FBS만을 첨가한 경우, Ca2+과 BPE, EGF를 첨가한 경우, Ca2+과 BPE, EGF와 FBS를 모두 첨가한 경우를 비교하여 보았다. 일차배양한 세포를 3700/cm2 농도로 접종하여 4일 배양한 경우 K-SFM Basal Medium은 총세포수가  0.36 x 106, K-SFM 에 Ca2+(1.5mM) 과 FBS(10%)를 첨가한  경우 0.42 x 106, K-SFM 에 BPE, EGF와 Ca2+(1.5mM)을 첨가한 경우 1.32 x 106, K-SFM에 BPE, EGF와 Ca2+과 FBS(10%)를 모두 첨가한 0.88 x 106으로 무혈청의 K-SFM에 BPE, EGF와 Ca2+만을 첨가하는 경우가 점막세포 성장을 가장 촉진시키는 것으로 나타났고 혈청첨가는 오히려 점막세포의 성장을 저해하는 것으로 나타났다.

Fig. 2. Effect of medium supplement on mucosal cell growth

Fig.3. Picture of mucosal cell growth according to medium supplement at 4 days culture( A: K-SFM Basal medium, B: K-SFM+Ca2++FBS, C: K-SFM+Ca2++BPE+EGF, D:  K-SFM+Ca2++BPE+EGF

3. 혈청농도의 영향

점막세포 성장에 미치는 혈청농도의 영향을 조사하기 위하여 K-SFM Basal Medium에 FBS를 5%, 10%, 15%, 20%씩 첨가하여 4일 배양한후 총 세포수와 세포 모양을 조사하여 보았다. FBS 농도가 증가함에 따라 세포 성장은 큰 영향을 받지 않았고 세포 모양이 크게 퍼지는 경향을 나타내므로 서 쉽게 노화되는 현상을 관찰할수 있었다.

결론

흰색 가토의 구강점막조직으로부터 점막세포를 분리한 결과 2-3x106/cm2 정도의 세포를 회수할수 있었고 BPE 50mg/L, EGF 5□/L, Ca2+ 1.5mM 로 조절한 무혈청의 K-SFM 배

Fig. 4. Effect of FBS concentration on mucosal cell growth

지를 10ml 함유한 T75-flask에 접종하여 37℃ CO2 incubator에서 배양한 결과 약 4-5일 만에 60-70% 정도 confluent하게 성장하는 것을 확인할수 있엇다. 분리한 세포의 성장에 미치는 배지 첨가물에 대한 영향을 조사한 결과 배지는 BPE, EGF, Ca2+를 함유한 무혈청의 K-SFM 배지를 사용하여 배양하는 경우가 가장 높은 세포 성장을 나타내었고, 혈청 농도가 점막세포 성장에 미치는 영향을 조사하여 본 결과 세포 성장에는 큰 영향을 미치지 않았으며 세포 모양이 퍼지는 현상이 발생하였는데 이것은 혈청이 세포를 쉽게 분화 시켜서 노화를 촉진시켰기 때문으로 사료된다.

참고문헌

1. Nobuyuki Kamata, Kazuhiro Yokoyama, Ryoichi Fujimoto, Naohiro Ueda, Eiji Hayashi, Hiroaki Nakanishi, and Masaru Nagayama, Growth of Normal Oral Keratinocytes and Squamous Cell Carcinoma Cells in a Novel Protein-Free Defined Medium., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 35:635-641, November-December 1999

2. Minoru Ueda, Koji Ebata, Toshio Kaneda,. In Vitro Fabrication of Bioartificial Mucosa for Reconstruction of Oral Mucosa: Basic Research and Clinical Application. Annals of Plastic Surgery Vol 27 No.6 December 1991.

3. Dorthe Arenholt-Bindslev, Arne Jepsen, Donald K. MacCallum and John H. Lillie, The Growth and Structure of Human Oral Keratinocytes in Culture., The Journal of Investigative Dermatology : Vol. 88, No. 3, March 1987.

4. Byung-Moo Min, Kyung Mi Woo, Gene Lee, and No-Hee Park, Terminal Differentiation of Normal Human Oral Keratinocytes Is Associated with Enhanced Cellular TGF-□ and Phospholipase C-□1 Levels and Apoptotic Cell Death., Experimental Cell Research 249, 377-385(1999)

5. Minoru Ueda, Ken-Ichiro Hata, Kunio Horie, Shuhei Torii, The Potential of Oral Mucosal Cells for Cultured Epithelium: A Preliminary Report., Annals of Plastic Surgery., Vol. 35, No. 5, November 1995