나노 키토산 유도체의 약물전달 효과

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

강익중／·이도헌

경원대학교 화학공학과

The drug delivery effects of nano chitosan derivatives.

Ik Joong Kang／ and Do Heon Lee

Department of Chemical Engineering, Kyungwon University, 461-701, KOREA

서 론

최근 21세기 생명공학의 발전과 더불어 건강과 생명연장에 관한 관심이 높아지면서 부가가치가 높은 의약관련 연구가 증가하고 있다. 그 중에서도 신제형 제제의 발전이 두드러 지는데 선진국에서는 20년 전부터 약물전달 시스템(Drug Delivery System; DDS)의 연구에 몰두해 왔고, 우리 나라에서도 제형 특허출현이 증가하는 추세로 나타나 신제형 개발을 통한 신약개발에 있어서 많은 진전을 보이고 있다.

본 연구에서 Chitosan의 유도체를 나노입자로 제조한 약물방출 조절용 팻취제는 온도에 따라 약물방출 속도를 조절 할 수 있고, 피부 활성제의 첨가로 약물 방출 능력을 증가시킬 수 있었다. Chitosan을 약물방출 제어용 고분자막으로 이용하여 in vitro 및 in vivo 실험을 하였으며 안정한 항생제인 Penicillin-G와 당뇨병 치료제인 Insulin을 저온에서 제조하여 각각의 약물특성과 약물방출 효과를 알아보았다. 최적의 약물 팻취제를 형성시키기 위한 온도, pH, 시간 등 기타의 조건을 최적화 하여 상기 약물에 대한 Chitosan 팻취제의 약물방출 효과를 보았으며, 점막을 통한 나노입자의 약물전달 효과를 보았다.

실  험

실험 장치 및 시약

본 연구에서 사용된 약물방출 장치(Drug Delivery system, DDS)는 이중의 온도 조절이 가능한 유리재질의 반응기에 MP-3 sampler와 Stirring controller, 온도계, 초음파 장치가 설치되어 있다. 항온조절 시스템은 반응기에 연결되어서 항온으로 조절되며 4 ℃와 36.5 ℃의 두가지로 실험을 한다. 약물 용기는 반응기 안에 들어가는 스테인레스 재질의 용기(규격: 지름 13□,부피가 5□)이다. 사용된 시약은 순도가 인정된 Chitosan(M.W: 50,000, 120,000), 흰색분말 성상의  Penicillin-G를 사용하였고 인슐린은 노보린 R을 사용하였고 Glycerol, DMSO, DMF, KHCO3, K2HPO4, KH2PO4, HCl등은 알드리지에서 구입하였다. 인슐린은 녹십자에서 구입한 노보린 R의 것을 사용하였고 나머지의 것 Glycerol, DMF, DMSO, KHCO3, K2HPO4, KH2PO4, HCl 등은 순도가 인정된 것으로 Sigma- Aldrich에서 구입하였다. 실험용 쥐는 한국 Taconic에서 구입한 수컷의 일반 mice와 5주령의 NOD mice (Non Obese Diabetic) Mice를 사용하였다.    (Fig.1 과 Fig. 2)

Fig. . NOD(Non Obese Diabetic) Mouse

Fig. .  Side view of NOD Mouse drug applied.

실험 방법

⑴ 약물의 제조

분자량이 다른 Chitosan(M.W:50,000, 120,000;이하 C1,C2)을 이용하여 제조한 용액을 Penicillin-G를 각각 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 2, 3%로 각각 1주일간 안정화하였다. Chitosan 약물을 화학적으로 안정한 스테인레스 재질의 용기 (Fig. 7)에 넣은 다음 표면을 같은 크기의 위생붕대로 고정하였다. 고정된 약물은 알카리를 이용해서 pH 8로 맞추어진 용액에서 중성화시킨 후 실험직전까지 4℃ 냉장조건의 Phosphate buffer solution (KHCO3:9 g/□, K2HPO4:1.4 g/□, KH2PO4: 1.1g, pH7.4)에 담가 두었다. 다른 분자량의 Chitosan 용액을 Insulin을 넣되 20%이상은 녹지 않으므로 실험은 Chitosan과 함유되는 10IU와 20IU로 정하였고 in vivo 실험에서 사용한 피부 활성제(DMSO, DMF등)을 같이 녹여 약물방출의 차이점을 관찰하였다. 나노입자는 서로 다른 농도의 키토산 용액과 TPP 용액을 혼합하여 생성하고 원심분리한 후 acetate buffer 또는 phosphate buffer로 처리하여 제조한다.

H2N   COOH                      H2N    COOH

H                                 H

COOH                         COOH

L-Glutamic acid                   L-Asparatic acid

COOH

COOH  O  OH   OH

O  OH    OH                                                  n

n

Alginic acid                               Pectic acid

⑵ Chitosan patch제의 약물방출 실험

약물들을 준비된 Phosphate buffer solution(pH7.4) 500□ 에 넣은 다음 항온 시스템으로 36.5 ℃가 되게 맞춘다. 이렇게 준비된  buffer solution에 Chitosan 약물을 넣은 후 speed 100 rpm으로 상청액을 교반시킨다. sampling은 30분을 기준으로 1, 2, 4, 8, 12, 24시간으로 2□씩 채취하여 3회 나온 값을 평균하였다.

⑶ 약물방출 효과의 분석

농도 측정은 페니실린의 경우는 UV spectrophotometer로 그리고 Insulin의  농도분석은 C-18을 분리용 컬럼으로 하여 HPLC(미국, Waters Inc.)를 사용하였으며, 혈당의 분석은 혈당 측정기인 Sure Step(미국, Lifescan Inc., 366-0182)의 것을 사용하였으며. Test strips는 역시 같은 Lifescan사의 code 9을 사용하였다.

나노입자의 관찰은 Zeta Potential과 AFM을 이용하여 크기와 분포를 측정하였다.

결과 및 고찰

본 연구에서 in vitro의 실험을 위해 Penicillin-G와 Insulin으로 약물을 나누어 진행하였다. Chitosan1(MW;50,000)에서 Penicillin-G 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 2.0, 3.0 %에서의 약물 방출 농도를 나타낸 것이다. 농도가 낮을 때에는 비교적 일정한 증가 상태를 볼 수가 없었다. 또한 약물방출의 급격한 증가로 Chitosan 1이 약물담체로서의 기능이 약함을 알 수 있다. Chitosan 2 (MW;120,000)에서 Penicillin-G 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 2.0, 3.0 %에서의 약물 방출 농도를 나타낸 것이며 비교적 완만한 증가의 그림을 나타내나 약물방출에 있어서는 더 좋은 값을 나타내었다. 실험은 25%까지 진행되었으나 5%이상은 약물이 chitosan과 균일 혼합이 되지 않으므로 유용하지 않았으며 낮은 농도보다 높을 때 일정한 값을 보였다. 30℃이상에서의 Chitosan 과 Penicillin-G의 혼합물 제조시에 변형이 되는 것을 볼 수 있었다. 분자량이 상이한 분자량이 상이한 Chitosan 1,2 (MW;50,000:MW;120,000)에서 Insulin10IU, 20IU의in vitro의 약물 방출을 나타낸 것이다. Chitosan으로 볼 때는 Chitosan2가 약간 더 약물방출의 특성이 있음을 알 수 있다. In vivo에서 사용되는 피부 활성제 (DMSO, DMF, Glycerol)가 in vitro 실험에서 어떻게 작용하는지 살펴보았다. 결과적으로 DMF의 경우만 방출이 다른 피부 활성제 보다 떨어 졌다. 페니실린과는 다르게 약물이 증가를 하다가 어느 시점에서 감소를 하게되는데, 본 실험에서는 약물의 온도에 따른 분해를 알기 위해 두가지 온도(4℃, 36.5℃)에서 실험을 하였으며 Insulin은 36.5 ℃에서 4 ℃보다 약 2.5배의 약물 분해가 있었다. Chitosan-insulin 팻취는 약물을 비교적 일정한 수준으로 방출함을 알 수 있었으며, 약물방출 실험에 있어서 chitosan을 적용하는 것은 효과적임을 알 수 있었다. 저분자의 chitosan보다 상대적으로 고분자의 chitosan이 약물방출의 담체로서 효율이 뛰어 났음을 알 수 있었고, 조건에 따라서 약물 방출량을 조절할 수 있다. Insulin을 함유한 chito- san은 저온보관 할수록 약물 방출량이 적어지고 insulin약물은 시간에 따른 분해가 있음을 알 수 있었으며 향후 다른 약물의 적용에 있어서도 중요한 결과이므로 이후에 체계적인 연구를 필요로 한다. 피부활성제의 효과를 비교하였을 때 DMSO가 in vivo에서 가장 효과가 좋았고 glycerol의 경우 별 효과가 없었으며 DMF의 경우는 오히려 약물방출 효과가 감소됨을 알 수 있었다. 결과적으로 키토산 유도체의 팻취에 의한 약물투여를 통해 적절하게 낮은 혈당치를 유지할 수 있었다.

참고문헌

1. G. Belfort, J. Membr. Sci., 40, 123-147 (1989).

2. G. Belfort and N. Nagata. Desalination, 53, 57 (1985).

3. H. Ohya, Q. Guo, and M. Shibata, Water Treatment, 9, 235 (1994).

4. J. M. Randall, and R. N. Toung, J. Appl. Polym. Sci., 23, 727 (1979).

5. J. Bjerrum, Hasse Copenhagen, 3, 1 (1941).

6. H. Ohya, Q. Guo, and M. Shibata, Water Treatment, 9, 235 (1994).

7. B. Champluvier, M. R. Kula,  J. Chromat., 539, 315 (1991).

8. H. Yoshida and T. Kataoka, Biotechnol. Prog., 34, 347 (1995).

9. A. R. Patel and G. F. Payne, Ind. Eng. Chem. Res., 33, 2168 (1994).

10. X. Zeng and E. Rckenstein, Ind. Eng. Chem. Res.,  35, 4169 (1996).

11.  S. Mitragotri,  Clin Pharmacol Ther.,  57, 98 (1995).

12. D. Marchi,  Horm Res.,  41(2), 93 (1994).

13. R. K. Campbell,  Ann. Pharmacother., 30,  1263 (1996).

14. S. Kang  et al.,  Diabetes Care, 14, 942 (1991).

15. D. C. Howey et al.,  Diabetes, 43, 396 (1994).

16. D. C. Howey et al., Clin Pharmacol Ther., 58,  459 (1995).

17. A. Miwa et al., Phaarm. research,  15(12), 1844 (1998).

18. E. W. Terbrak et al.,  Diabetes Care , 19:, 437 (1996).

19. E. Torlone et al.,  Diabetologia , 37, 713 (1994).

20. N. D. Stephen , Pharmocological basis of therapeutics, 78, 1487 (1996).

21. E. Klein, E. Eichholz, and D. H. Yeager, J. Membr. Sci., 90, 69 (1994).

22. E. Guibal and M. Jansson, 11, 591 (1995).

23. H. Hayatsh and T. Kubo, Chem, Pharm. Bull., 45, 1363 (1987).

24. S. K. Garg et al., Diabetes,  43, 162 (1994).

25. R. Bergenstal et  al.,  Diabetes,  43, 57 (1994).

26. M. R. Letiexhe et  al.,  Diabetologia , 37, 168 (1994).

27. N. S. Fineberg  et  al.,  Diabetes,  45, 1750 (1996).

28. B. R. Olin  et  al., Drug facts and comparisons,  533 (1995).

29. T. Kataoka and H. Yoshida, Chem. Eng. J., 37, 107 (1988).

30. N. Nishi, J. Noguchi, S. Tokura, and H. Shiota, Polymer J., 11, 270 (1979).

31. S. Pampanelli  et al.,  Diabetes Care, 18, 1452 (1995).

32. J. H. Anderson et al.,  Diabetes,  46, 265 (1997).