콜라젠 비드를 이용한 생인공간 개발

이두훈, 박정극

동국대학교 화학공학과

Development of a Bioartificial Liver Using Collagen Bead

Doo-Hoon Lee, Jung-Keug Park

Department of Chemical Engineering, Dongguk University, Seoul, Korea,

서 론

최근의 의학 발달에도 불구하고 전격성 간손상(fulminant hepatic failure, FHF) 환자의 경우 치사율이 90%에 이르고 있으며 이러한 경우에는 장기 이식이 현재까지는 가장 높은 생존율을 보이는 치료 방법이다. 그러나, 기증되는 장기의 심각한 부족현상으로 인하여 환자들은 이식될 간이 얻어지기 전에 사망하고 있다. 또한 최근에 간의 생체 부분 이식(living-related partial liver transplantation)이 증가하고 있으나 이러한 경우에도 적당한 기증자를 찾기까지의 기간 동안 환자의 생명과 의식을 연장하여야 하며, 이를 위해서는 인공간 보조장치가 반드시 필요하게 된다. 혈장교환이나 혈액투석여과로 약간의 효과가 나타나기는 하였으나 간이 수행하는 많은 대사적 및 생리적 기능으로 볼 때 분리된 간세포를 이용하는 생인공간(bioartificial liver)이 효과적인 보조역할을 수행할 수 있을 것으로 여겨지고 있다. 최근 돼지 간세포 및 인체 간암 세포주와 중공사막 모듈을 이용한 다양한 생인공간 시스템이 개발되어 임상실험을 진행하고있다(1).

본 연구에서는 단층으로 배양된 경우보다 간의 특이기능이 우수한 간세포 구상체(spheroid, 간세포의 구형 응집체)를 교반용기를 이용하여 대량으로 형성시켰으며 간세포 배양에 적합한 세포외 기질성분의 하나인 콜라젠 젤 비드 내에 고정화하였다. 간세포 구상체가 고정화된 콜라젠 젤 비드가 충진된 형태의 생인공간 시스템(CB-BAL, collagen bead bioartificial liver)을 개발하였으며 in vitro 성능 시험을 실시하였다. 간부전 환자의 주요 독성 노폐물인 암모니아를 배지에 인위적으로 첨가한 결과 효과적으로 제거되었으며 높은 알부민 분비 능력을 일주일 이상 유지하였다. 이상의 결과로 볼 때 콜라젠 비드를 이용한 생인공간은 높은 개발 가능성을 가진 것으로 판단된다.

실험 재료 및 방법

간세포의 분리는 Seglen-method(2)에 기초를 두고 변형된 방법을 실행하는데, 이는 in situ 상태에서 collagenase로 간의 기질을 분해하여 간세포를 얻는 기술로서, 2단계로 시행하는데 그 방법은 다음과 같다. 180-200 g 체중의 Sprague-Dawley rat을 사용하였으며 trypan blue staining 방법에 의하여 세포 수를 측정하였다.  보통 200 g의 쥐로부터 약 2-3 × 108 개 정도의 간세포를 회수할 수 있으며 viability는 90% 이상이다. 분리된 간세포는 교반용기에서 부유배양하여 간세포 응집체를 형성한 후 사용하였다(3, 4).

배양 배지로는 William's E Medium에 Epidermal growth factor(20□g/l), Insulin (10mg/l), Hydrocortison(3.4□M), CuSO4·5H2O(0.1□M), ZnSO4·7H2O(50pM), H2SeO3(3□g/l), Linoleic acid(50mg/l), NaHCO3(1.05g/l), HEPES(1.19g/l), Penicillin(0.0588g/l), Streptomycin (0.100g/l)을 첨가하여 사용하였다.

간세포 응집체는 본 연구실에서 고안한 방법을 사용하여 콜라젠 비드 내에 고정화하였으며(5) 그 방법은 Fig. 1에 간단히 나타내었다.

Fig. 1 Schematic diagram of a process for collagen gel bead preparation

콜라젠 bead는 typeⅠ의 콜라젠(Sigma rat tail)을 아세트산에 녹여 10mg/ml 농도의 콜라젠용액을 만들어 사용하며, 미리 배양된 간세포 구상체를 회수하여 pH7.2-7.4의 60mM의 calcium이 든 배지용액과 함께 콜라젠용액에 넣어 분산시킨 후 23G의 끝이 무딘 주사기 바늘을 통하여 0.75%의 alginate용액으로 떨어뜨려 바깥층에 Ca-alginate 피막을 가진 콜라젠 bead를 만든다. 이때 멸균된 공기를 바늘 뒤에서 16□/min의 유속으로 불어주어 bead크기를 작게 조절하였다. 이때 bead내의 cell density는 1×107cells/ml 콜라젠이다. 그리고 37℃에서 45분간 방치하여 콜라젠을 젤화(gellation)시키고, 이것을 sodium citrate buffer(SCB, 50mM sodium citrate, 0.47% NaCl, 20mM D-frutose, pH7.4)에 6분간 넣어서 물질전달의 저항이 될 수 있는 바깥층의 alginate피막을 녹여낸다. 이렇게 콜라젠에 고정화된 간세포 스페로이드는 Fig. 2와 같은 유동층 반응기 형태의 인공간 시스템으로 제작되었다. 이렇게 제작된 콜라젠 비드 생인공간 시스템(CB-BAL)의 성능은 본 연구자들이 앞서 개발한 폴리우레탄 폼 충진형 생인공간 시스템(PUF-BAL)(6)과 비교평가 되었다.

Fig. 2 Collagen bead bioartificial liver (CB-BAL) for in vitro performance test

(1.Medium  2.Oxygenator  3.Pump   4.Bubble trapper  5.Bioreactor

6.DO analyzer)

배양된 간세포 구상체의 detoxification능력을 조사하기 위하여 암모니아의 분해속도를 아산제약의 indophenol kits를 사용해서 측정하였고 이에 따른 urea 생성농도는 Blood urea nitrogen assay kit(Sigma Co.)를 사용하여 측정하였다. 암모니아의 제거 속도를 측정하기 위하여 배양 3일째 부터 1mM NH4Cl을 첨가한 배지를 사용하였다. 간세포의 중요한 대사기능의 하나인 알부민의 합성 및 분비는 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 법을 사용하였는데, 1차항체(IgG fraction to rat albumin), 알부민 표준, 2차항체(Peroxidase-Conjugated IgG fraction to rat albumin)는 OGARNON TECHNIKA CORPORATION 시약을 사용하였으며, 1차항체는 2□/□를 2차항체는 1/5000을 사용하였다.

결과 및 토의

생인공간 시스템 제조

폴리우레탄 폼을 이용한 생인공간은 직경 3mm의 폴리우레탄 폼 조각과 간세포를 함께 혼합한 후 원심분리를 하여 간세포를 접종하였으며 이를 충진하여 제조하였다. 폴리우레탄 폼의 pore에 접종된 간세포는 구상체를 형성하게된다.

콜라젠 비드를 이용한 생인공간은 앞서 설명한 방법으로 고정화된 간세포를 충진하여 생인공간을 제조하였다. 충진된 콜라젠 비드의 일부는 유동층 반응기에서와 같이 부유되는 현상을 나타내었다. Table 1에 두가지 생인공간 시스템의 특성을 비교하였다.

Table 1. Details of the CB-BAL and PUF-BAL for in vitro performance test

생인공간 시스템의 간기능 평가

Fig. 3은 두가지 생인공간 시스템의 간기능 활성을 비교한 것이다. 암모니아 제거능은 비슷하게 나타났으며 알부민의 분비량은 콜라젠 bead 반응기의 경우가 PUF 보다 배양 4일째부터 계속 높게 유지되었다. 알부민 분비량의 이러한 증대 효과는 정치 상태의 콜라젠 젤에서도 확인되었던 결과로서 콜라젠과 같은 세포외기질(ECM) 성분이 간세포의 특이 기능을 오래 유지시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 간세포의 어떤 기능이 생명 보조에 필수적 요소인지 아직 확실히 규명되지 않은 시점에서 중요한 간의 특이 기능인 알부민 분비가 유지된다는 것은 중요한 의미를 가지는 것으로 생각된다. 따라서, 콜라젠 비드를 이용한 생인공간은 상당한 가능성을 가지고 있는 것으로 판단된다. 성능면의 이러한 장점 외에 콜라젠 비드의 또 한가지 장점은 콜라젠 비드 내의 간세포 농도를 마음대로 조절할 수 있다는 것이다.

Fig. 3 Comparison of Liver Specific Functions between CB-BAL and PUF-BAL.

참고 문헌

1. Jacek Rozga, Achilles A. Demetriou, et.al.,"Isolated Hepatocytes in a

Bioartificial Liver: A Single Group View and Experience", Biotechnology

and Bioengineering, Vol. 43, 645-653, 1994.

2. Seglen P.O.,"Preparation of Isolated Rat Liver Cells", Meth. Cell. Biol., Vol.

13, 29-83, 1975

3. 이두훈, 류재남, 양은경, 정미경, 박순희, 박정극, □교반 용기를 이용한 쥐 일차

간세포의 구상체 배양□, 한국생물공학회지, 12(4), 449-455, 1997.

4. S. M. Yang, D. H. Lee, J. K. Park, "Effects of Degree of Cell-Cell Contact

on Liver Specific Functions of Rat Primary Hepatocyte", Biotechnology and

Bioprocess Engineering, 5(2), 99-105, 2000

5. Kim, S. P., D. H. Lee, and J. K. Park, Development of hepatocyte spheroids

immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnol.

Bioprocess Eng. 3: 96-102, 1998.

6. 이두훈, 이지현, 김성구, 박정극, □다공성 폴리우레탄 충진형 생인공간의 체외

성능 평가□, 한국생물공학회지, 16(1), 2001. (in press)