pH 반응성 약물전달을 위한 BSA Tablet의 제조와 팽윤특성의 수학적 모사

김준배, 박성배, 박함용, 함승주, 김우식

연세대학교 공과대학 화학공학과

Preparation of Thermally Denatured BSA Tablets for pH-Sensitive Drug Carrier : Swelling Modeling

Junbae Kim, Seong-Bae Park, Ham-Yong Park, Seungjoo Haam, and Woo-Sik Kim

Department of Chemical Engineering, College of Engineering,

Yonsei University, Seoul 120-749, Korea

서론

최근 약물전달시스템에 대한 관심사는 주로 표적지향성 전달수송체의 제조법에 집중되어 있으나, 생체적합성이라는 측면에서 전달수송체의 소재를 선택하는 것은 여전히 어려운 문제로 남아있다. 합성고분자의 경우 충분한 생체적합성이 보장되는 것은 드문 일이므로, 천연고분자는 아직도 상당한 매력을 지닌다고 할 수 있다. 특히 단백질의 일종인 알부민은 그 특성들 - 우수한 생체적합성, 화학적 수정이 가능함, 물에 대한 높은 용해도, 우수한 emulsification capacity, heat coagulability - 로 인하여 전달수송체의 소재로서 큰 가능성을 지니고 있으며 특히 heat coagulability를 이용하면 50℃ 이상의 온도에서 알부민의 분자들 사이에 가교반응을 일으키는 것이 가능하다. 이러한 자발적인 가교결합은 다른 천연고분자와 달리 가교제와 같은 첨가물을 필요로 하지 않기 때문에 생체적합성의 측면에서 유리하며, 가교제를 사용했을 경우 필연적인 세척 공정의 생략이 가능하기 때문에 전달수송체의 제조시에도 큰 장점을 지닌다고 할 수 있다. 본 연구는 이러한 알부민의 특성을 이용하여 열변성 BSA tablet을 제조하고, 일정한 환경변수 하에서 pH의 변화에 따른 팽윤제어기구의 특성을 고찰하며, Flory-Huggins식을 이용한 팽윤특성의 수학적 모사를 통해서 장차 약물의 전하와 외부 pH에 따라 약물방출속도의 차이를 나타내는 pH 반응성 팽윤제어계를 구현하고자 하였다.

이론

팽윤특성의 수학적 모사는 이온성 고분자 젤과 팽윤용액와의 삼투압 평형을 그 기반으로 한다.

··· (1)

(1)식에서 전체 삼투압(□T)은 혼합에 의한 삼투압(□M), 망 탄성에 의한 삼투압(□E), 이온농도차에 의한 삼투압(□ion)의 합과 같으며 평형에서 0이 된다. 여기서 양변을 RT로 나누고 □ion/RT을 Flory-Huggins식으로 나타내면 (2)식과 같다.

··· (2)

VH2O는 물의 몰부피, Vr, Vrm은 각각 팽윤된 젤과 제조된 직후의 젤에서 BSA의 부피분율, □는 polymer-solvent interaction parameter, □e/Vm는 crosslinking density이다. 또한 Z를 카르복실기와 아미노기의 이온반응식으로 나타내면 (3)식과 같다.

··· (3)

K1, C1은 각각 카르복실기의 해리상수와 농도, K2, C2는 각각 아미노기의 해리상수와 농도, [H+], CS*는 각각 팽윤용액의 수소이온농도와 이온농도, □는 BSA 젤 안팎 이온농도차의 비이다. 실험을 통해 (3)식에서 Z의 값을 구한 후 이를 (2)식에 대입하고 Vr에 대해 풀어서 BSA 젤의 팽윤특성을 모사할 수 있게 된다.

실험

1. 열변성 BSA Tablet의 제조

먼저 Bovine serum albumin (BSA, SIGMA Chemical Co., A-7906)을 초순수에 120g/l의 농도로 용해시킨다. 이 용액을 4등분하고 0.5N HCl, 0.5N NaCl을 사용하여 BSA 용액의 pH를 각각 3.50, 4.80 (BSA의 등전점), 7.00 (BSA 용액의 초기 pH), 10.0으로 조절한다. pH 조절이 끝난 용액들은 5000rpm에서 30분간 원심분리하고 그 상청액들을 직경 13mm의 원통형 몰드에 넣고 water bath에서 80℃의 온도로 1시간 동안 가열한다. 가열 후 몰드들을 ice bath에서 90분간 냉각하고 열변성된 BSA gel을 몰드에서 꺼내 6mm 두께로 절단한다. 이를 desiccator에 넣고 상온에서 완전 건조시켜 열변성 BSA tablet을 얻는다.

2. FTIR 분석

건조된 BSA tablet을 분쇄하여 일정량(0.1g)의 BSA 분말을 KBr 분말과 1:10 중량비로 혼합하여 FTIR 측정용 팰릿을 제조한다. 이 팰릿을 BSA tablet의 제조 pH별로 각각 제조하여 FTIR 피크를 측정한다.

3. DSC 분석

건조된 BSA tablet을 DSC pan에 적합한 크기 (약 10mg 상당)로 쪼갠 후 pan에 넣고 밀봉하여 DSC cell을 제작한다. 이 cell을 DSC에 넣고 25℃∼220℃ 범위에서 열유량을 측정한 뒤 발생한 피크를 적분하여 □H값을 구한다.

4. 팽윤 실험

건조된 BSA tablet의 무게를 측정하고 팽윤용액으로서 pH 1.40, 2.50, 4.60, 5.50, 6.50, 7.40, 8.60, 9.20, 10.6의 인산완충용액(이온강도 0.2로 고정)과 4가지 pH의 BSA tablet으로 팽윤계를 조성한다. 이들을 incubator (SI-900 shaking incubator, Jeio tech, Korea) 안에 넣고 37.5±0.5℃, 100rpm의 조건에서 36시간 동안 팽윤시킨다. 평형에 도달한 BSA tablet에서 표면의 물기를 닦아내고 무게를 측정한다.

결과 및 토론

1. 열변성 BSA Tablet의 제조

BSA를 열변성시킨 결과 제조 pH 4.80의 경우 불투명한 gel이, 제조 pH 3.50, 7.15, 10.0의 경우 투명한 gel이 제조되었다. 이는 pH 4.80의 경우 0.5N HCl을 이용하여 pH를 낮추는 과정에서 상당량의 aggregation이 발생한 것과 달리 pH 3.50, 7.15, 10.0의 경우 aggregation이 거의 발생하지 않았기 때문이다. (Fig. 1)

2. FTIR 분석

제조 pH별 BSA 팰릿을 FTIR로 측정한 결과 C=O, C-N, N-H 피크가 검출되었다. (Fig. 2) 이는 BSA의 열변성이 카르복실기와 아미노기 사이의 가교에 의해서 일어난다는 가설을 뒷받침하는 것이다.

3. DSC 분석

BSA에 대한 DSC 측정 결과 BSA의 제조 pH가 증가할수록 면적이 넓은 흡열 열유량 피크가 나타났다. (Fig. 3) 이 피크들을 적분하여 단위질량당의 엔탈피를 구할 수 있었고, 이에 시료의 무게를 곱하여 BSA의 반응열을 구할 수 있었다. 엔탈피값 역시 BSA의 제조 pH가 증가할수록 높아짐을 알 수 있었다.

4. 팽윤 실험

BSA tablet을 다양한 pH의 인산완충용액에서 팽윤시킨 결과 BSA의 등전점 (pH 4.80) 부근에서 팽윤도가 가장 작았고, pH가 낮아지거나 높아질수록 그 값이 커지는 것으로 나타났다. (Fig. 4) 이는 등전점에서는 BSA 분자의 net charge가 최소가 되고 따라서 열변성된 BSA chain 사이의 정전기적 척력이 최소가 되는데 비해 pH가 등전점보다 낮거나 높을 경우에는 net charge가 증가함으로 인해 정전기적 척력이 증가하기 때문이다. BSA tablet의 팽윤도를 선형회귀하면 제조시의 pH에 따른 BSA의 pH sensitivity를 근사치로 나타낼 수 있다. 더 분명한 비교를 위하여 선형회귀선의 기울기를 BSA tablet의 제조 pH에 대해서 fitting하면 BSA의 제조 pH가 낮아지거나 높아질수록 pH sensitivity가 증가한다는 사실을 알 수 있다. (Fig. 5) 이는 BSA의 제조 pH가 등전점보다 낮아지거나 높아질수록 이온화된 아미노기와 카르복실기의 양이 증가하기 때문이다.

5. 팽윤특성의 수학적 모사

BSA 젤의 팽윤특성을 수학적으로 모사한 결과 팽윤용액의 pH와 팽윤특성의 관계를 설명할 수 있었고, 실험값과도 잘 일치하는 경향을 보여주었다. (Fig. 6)

결론

BSA 분자의 전하 분포는 BSA 용액의 pH에 따라 달라진다. 따라서 열변성 BSA tablet의 구조 역시 BSA 용액의 pH에 따라 달라지게 된다. 이처럼 제조시의 pH에 의해 결정된 열변성 BSA의 구조는 BSA tablet의 가장 중요한 특성인 팽윤도와 pH sensitivity를 결정하는 요인이 되기 때문에, 제조시 BSA 용액의 pH를 조절함으로써 BSA tablet의 팽윤도와 pH sensitivity를 조절할 수 있다. FTIR과 DSC 측정에서 제조 pH에 따라 경향성이 있는 피크가 검출되었다는 사실이 이러한 가능성을 뒷받침한다. BSA tablet의 팽윤도는 BSA의 등전점에서 최소가 되고 등전점보다 팽윤용액의 pH가 낮아지거나 높아질수록 증가하는 추세를 보인다. pH sensitivity 역시 BSA의 등전점에서 최소가 되고 제조 pH가 등전점보다 낮아지거나 높아지면 증가한다. 특히 등전점보다 낮은 pH보다는 높은 pH에서 더 큰 pH sensitivity를 보였다. 팽윤특성의 수학적 모사를 통해서 외부 환경의 pH에 따른 BSA tablet의 팽윤특성을 예측할 수 있게 되었고 이상의 모든 연구결과를 바탕으로 pH 감응성 팽윤제어기구의 설계와 구현이 가능해지게 되었다.

참고문헌

[1] Giancola, C and De Sena, C. J. Int. Biol. Macromol. 1997; 20: 193

[2] Bramaud, C. and Aimar, P. Biotechnol. Bioeng. 1997; 56(4): 391

[3] Park, H. and Song, I. Int. J. Pharmaceutics 1998; 175: 231.

[4] Lee, K and Asher, S. A. J. Am. Chem. Soc. 2000; 122: 9534

[5] Flory, P. J. Principles of Polymer Chemistry; Cornell University Press, 1953

Fig. 1. Turbidity

Fig. 2. FTIR Analysis

Fig. 3. DSC Analysis

Fig. 4. Degree of Swelling

Fig. 5. pH Sensitivity

Fig. 6. Swelling Modeling (pH 7.00)