Pluronics가 첨가된 Poly(L-lactic acid) 다공성 지지체 제조

김고은, 김현도, 이두성*

성균관대학교

Preparation of macroporous poly(L-lactic acid) scaffold

in the presence of Pluronics

G. E. Kim, H. D. Kim, D. S. Lee*

Sung-kyun Kwan university

서론

규칙적이고 공극간의 연결성이 우수한 100-300□m의 poly(L-latic acid)(PLLA) scaffolds는 미량의 Pluronics가 첨가된 3성분계 용액에 thermally-induced phase separation(TIPS)을 적용하여 제조된다. F-127, F-68,P-123의 Pluronics가 첨가된 상 분리도는 P-123, F-68, F-127의 순서로 점차 상승함을 볼 수 있다. 이는 Pluronics 분자내의 hydrophilic 부분인 PEG 사슬의 길이에 따른 영향으로 상 분리의 가속 시키기 때문이다. 상 분리 유도 시간 중에는 계면 안정시킴으로써 공극의 성장 속도를 둔화시킨다.

이론

조직공학은 현대의 많은 질병이나 사고로 인해 손상되거나 파괴된 장기의 복원

을 연구하는 학문이다.1 특히 우리나라 경우에는 유교 사상으로 인해 장기 기증

자가 절대 부족하므로 조직 재생의 연구 개발이 어느나라 보다 시급하다 할 수

있다. 조직 재생을 위한 재료로는 콜라겐과 같이 인체 내에 존재하는 천연 재료

와 각종 고분자로 대표되는 인공 재료가 있다. 또한 세포의 점착 성장을 위해 3

차원적 다공성을 지녀야 한다. 다공성 지지체의 제조법으로는  염 침출법

(solvent-casting and particulate-leaching method), 발포염법(gas-foaming

method),  fober extrusion 법, 유화 동결법(Emulsion-freeze drying method)과

상 분리법(thermally-induced phase separation)2-5등이 있다.

본 연구에서는 공극간의 연결성이 우수하고 공극 형태의 규칙적을 갖는 지지체

제조를 위하여 상 분리법을 이용하고자 하였다. 본 연구에 앞선 연구에서7 TIPS

법을 이용하여 80□m이상의 공극을 갖으며 공극간의 연결성과 공극의 규칙성을

갖는 scaffolds를 제조하였다. 허나 상 분리 유도 온도에서 PLLA가 결정화 됨으

로 인해 시간에 따른 형태 변화를 볼 수 없었다. 이에 Pluronics를 첨가하여

PLLA의 결정화를 막는 온도에서의 다공성 scaffolds를 제조하고자 한다.

실험

시약 : Poly (L-lactic acid) (PLLA, Mw : 218,000 PDI : 1.55, Shimadzu)의 good-solvent로는 1,4-dioxane을 non-solvent로는 distilled water를 사용하였다. 이의 첨가제로는 Pluronics(poly(oxyethylene)-poly(oxypropylene)-poly(oxyethylene))인 F-127, F-68, P-123(fig 1)(BASF)(Table 1)를 정제 없이 사용하였다.

Cloud-point temperature 측정 : 각각의 Pluronics(F-127, F-68, P-123)가 미량 첨가 된  3 성분계(PLLA-dioxane-water)의 상 분리 온도는 시각적 혼탁정도로 측정하였다. 샘플은 4-ml vial에 PLLA solutions (1, 3, 4.5, 5.5과 7wt%)과 각각의 Pluronics(F-127, F-68, P-123)를 다른 농도(0.1, 0.5, 0.9wt%)로 첨가하여 제작하였다. 1,4-dioxane/water의 혼합 용매는 무게 비로 정량을 하였으며 혼합 비율87/13로 고정하였다. 정량 된 샘플은 예상 상 분리 온도의 약 15oC정도 높은 온도에서 magnetic stirrer를 이용하여 단일상(homogeneous, one-phase) 용액으로 만들었다. 이렇게 만들어진 용액을 1oC/10min의 속도로 온도를 낮추며 혼탁해지기 시작하는 점을 상 분리 온도로 결정하였다. 오차범위는 1oC내외이다.

Scaffolds preparation : 4-ml vial에 PLLA를 정량 한 후 1,4-dioxane/water 혼합용매(87/13, wt)와 Pluronic solution을 첨가하였다. 이 때 PLLA는 용액의 4.5wt%로 고정 시켰다. 전체 용액의 용융을 위해 63oC에서 stirring 시켰다. 한 series의 샘플을 제작하기 위해서는 동일한 샘플을 측정하는 시간 간격의 수 만큼을 만들어야 하기 때문에 우선적으로 이 샘플들의 상 분리 온도를 측정한 후에 동일한 조건임을 확인하였다. 동일한 상 분리 온도를 갖는 샘플들은 상 분리 온도보다 약 15oC으로 단일상 용액으로 만든 후 측정할 냉각 온도(quenching temperature)로 4-ml vial 채로 넣은 후 관찰 하고자 하는 응집시간(2, 5, 10, 30, 60, 120)이 되면 액체 질소에 넣어 마이너스 이하의 온도로 급냉 시켜서 응집 시간동안의 상 분리 형태를 고정 시켰다. 액체 질소에 약 한시간 동안 고정시킨 후 동결 건조 시의 혼합 용매의 증발을 위해 vial의 상층부를 전기 칼을 이용 잘라버린 후 77oC, 7mm Torr의 동결 건조기에 3일간 방치하였다.

PLLA scaffolds는 Pluronics의 첨가 없이 동일한 방법에 의해 얻어진 결과이다.

Morphology charaterization : Scaffolds의 다공성 여부는 scanning electronic microscopy(SEM, Hitachi S-2150)을 통해 측정하였다. 측정면은 액체 질소로 충분히 샘플을 얼린 후에 샘플의 세로 방향으로 자른 후 백금 코팅하여 관찰하였다.

결과 및 토론

Pore size나 pore의 형태에 따른 다공성 scaffold의 형태는 고분자 용액의 열역

학적 상태에 따라 결정된다. 이런 공극의 형태는 상 분리를 진행 시키는 냉각과

정을 통해 획득되어진다. 상 분리 냉각과정은 상 분리 진행 온도(quenching-

temperature)와 상 분리 진행 시간(aging time),  상 분리 온도로부터의 냉각정도

(quench depth)와 같은 변수의 함수로써 나타난다. 이런 변수의 최적값을 통해

조직 재생을 위한 다공성 scaffold의 제조가 가능하데 된다. 상 분리는 nucleation

and growth와 spinodal decomposition의 두 mechanism에 따라 선택적으로 이루

어 진다. 냉각 온도에 따라 상 분리 거동의 우세 지역을 예측할 수 있기 때문에

우선적으로 용액의 상 분리도의 측정되었다.

figure 1은 dioxane/water의 비율을 87/13으로 고정시켜 두고 Pluronics의 첨가에

따른 용액의 상 분리 거동을 보았다. Pluronics중 F-68를 0.1wt%넣었을 때 pure

PLLA 용액에 비해 상 분리 온도변화는 거의 없었으나 F-68의 농도가 높아짐에

따라 상 분리 온도가 상승함을 알 수 있었다. 이에 각기 다른 종류의 Pluronics에

따른 상 분리 거동을 알아보았다. figure 2에서 보는 것처럼 동일한 농도의

Pluronics series를 첨가 하였을 때 F-127>F-68>P-123순으로 상 분리 온다가 상승

함을 알 수 있다. 이러한 현상은 Pluronics 분자가 hydropilic한 PEG 사슬과

hydrophobic한 PPG한 사슬을 갖은 block 공중합체이기 때문에 나타나게 된다.

Kawakatsu는 3 성분계 내에서 diblock이나 triblock을 첨가하였을 때의 상 분리

거동에 대하여 이론적 연구를 수행한 바 있다. 이를 통해 hydropilic한 부분이

핵으로써 작용하여 상 분리 거동을 가속화 함을 알 수 있다. 본 연구에서 사용하

는 Pluronic는 위에서 언급했듯이 PEG-PPG-PEG의 공중합체이다. 또한

F-127>F-68>P-123의 순서로 PEG 사슬길이가 긴 것을 알 수 있다. 위의 근거를 토

대로 figure 2의 상 분리거동은 hydrophilic한 PEG의 사슬길이에 따른 것임을 확

신할 수 있었다. figure 1과 figure 2의 상 분리도를 근거로 다공성 scaffold를 제

조하여 조직 재생을 위한 최적의 조건을 확인하고자 하였다.

figure 3은 F-127를 첨가하여 온도에 따른 상 분리 거동을 SEM으로 확인하였다.

F-127을 첨가한 PLLA 4.5wt% 용액의 상 분리 온도는 figure 2에서 알 수 있듯이

48oC이다. 상 분리 온도와 3oC 차이를 갖는 45oC에서는 상 분리 거동시간(aging

time)의 변화에도 scaffold 형태 변화는 볼 수가 없었다. 이는 nucleation and

growth에 따른 상 분리 거동을 나타내기 때문이다. 이에 반해 35oC에서는

spinodal decomposition의 mechanism에 따른 상 분리 거동을 하기 때문에

60min 경과 후에는 200□m이상의 pore를 형성하게 된다. figur 3의 b)와 c)의 비

교를통해 너 낮은 온도에서 상 분리를 유도할 경우 상 분리가 더 빠리 진행됨을

확인할 수 있었다. figure 2에선 각기 다른 Pluronics를 첨가하여 상 분리도의 변

화를 알 수 있었다. 이에 상 분리도 변화에 따른 scaffold 형태의 변화를 알아보

았다.figure 4의 a)는 Pluronics가 첨가되지 않은 pure PLLA 용액상의 상 분리 거

동이다. 빠른 시간내에 상 분리가 마지막 단계까지 진행 됨을 볼 수 있다.

figure 2에서 pure PLLA용액과 거의 동일한 상 분리 온도를 가졌던 b)는 a)보다

느린 속도로 상 분리 됨을 볼 수 있다. 상 분리 온도로부터 냉각 온도까지의 냉

각 깊이가 가장 큰 d)의 용액도 다른 Pluronics가 첨가된 b)나 c)의 경우보다 빠

르게 진행 됨을 알 수 있다. 하지만 상 분리 거동을 가속화 시켜 상 분리 온도를

상승시킨 것에 비해 Pluronics를 첨가하였을 때 전체적으로 pure PLLA 용액보다

상 분리 거동 속도가 감소시켜 공극의 크기를 통제 할 수 있었다.

figure 4를 통해 Pluronics가 상 분리 유도 시간(aging time)중에는 hydophilic한

부분과 hydropobic한 부분으로 인한 계면 장력을 줄여 상 분리 속도를 지연시킴

을 예측할 수 있었다. 또한 상 분리 온도를 증가시킴으로 인해 pore의 성장을 가

능하게 하는 spinodal 영역의 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 이를 통해 동일

한 냉각 깊이 온도에서 pure PLLA가 결정화 됨으로 인해 pore의 성장되지 못했

으나 Pluronics를 첨가했을 때는 상 분리 온도가 상승되었으므로 PLLA가 결정화

되지 않는 온도에서 scaffolds를 제조할 수 있으며 또한 시간에 따른 공극의 형태

도 통제 됨을 알 수 있다.

참고 문헌

1. C. A. Vacanti and J. P. Vacanti, Function organ replacement: The new       technology of tissue engineering. ed. By R. L. Tawes, Surgical              Technology, London 1991 : Centry press

2.	A. G. Mikos, G. Sarakinos, S. M. Leite, J. P. Vacanti and R. Langer,  Biomaterials, 14(5), 323-330 (1993)

3.	A. G. Mikos, A. J. Thorsen, L. A. Czerwonka, Y. Bao, R. Langer, D. N. Winslow and J.  P. Vacanti,  Polymer, 35(5), 1068-1077 (1994)

4.	D. J. Mooney, D. F. Baldwin, N. .P Suh, J. P. Nacanti and R. Langer, Biomaterials, 17, 1417-1422 (1996)

5. Y. S. Nam and T. G. Park, J. Biomed. Mater. Res., 47, 8-17 (1999)

6. Y. S. Nam and T. G. Park, Biomaterials, 20, 1783-1790 (1999)

7. F. J. Hua, G. E. Kim, D. S. Lee, submitted to J. Biomed. Mater. Res.