광간섭 바이오센서용 Si wafer의 식각조건 확립과

내분비교란물질(Alachlor)의 검출

김춘일, 류천수, 이종민, 김병우

성균관대학교 화학공학과

Interferometric biosensing of endocrine disruptor-alachlor using porous Si wafer with optimized etching condition

Chun-Il Kim, Chun-Soo Ryu, Jong-Min Lee, Byung-Woo Kim

Department of Chemical Engineering, Sungkyunkwan University

서론

산업 발전과 함께 면역기능을 약화시키고 imposex 현상을 일으키는 내분비 교란물질들이 커다란 환경문제로 대두되었다. 살충제 혹은 제초제로 잘 알려진 alachlor는 내분비 교란물질의 하나로 보고되고 있다 (1, 2).

본 실험에서 사용된 유전자 재조합 균주 E. coli ACV1003는 외부오염물질에 대한 DNA damage 발생시 대응효소로서 □-galactosidase를 분비하며, 이 □-galactosidase의 생성량을 분석함으로서 환경호르몬으로 널리 알려진 물질들을 정량적으로 검출하고자 한다.

본 실험에서는 기존의 생물학적 분석법과 porous silicon wafer 표면 위의 광간섭효과를 이용한 분석법을 비교 분석하였다.

이론

DNA손상의 결과로 유발되는 SOS regulatory system 이라 부르는 복잡한 세포성 기작의 중간생성물로 □-galactosidase가 나타난다 (3).

SOS 조절계에서, DNA손상이 세포에 조작신호를 보내면, DNA복구에 관련된 많은 수의 세포성 기능이 계속적으로 억제된다. SOS계는 정상적으로 LexA단백질에 의해 억제되고 DNA 손상의 결과로 생성된 RecA(DNA 손상시 발현되는 단백질 분해효소 관련 유전자)는 LexA repressor를 분해하여 SOS계가 작동, 손상된 DNA가 복구되기 시작한다. 손상된 DNA의 복구가 완료되면 RecA의 활성이 떨어지고 LecA가 세포내에 축적하게 되어 SOS계는 다시 억제되게된다(4, 5).

생성된 □-galactosidase는 고전적인 enzyme assay 방식으로 정량할 수 있으나, 이를 위해 cell harvest 및 여러 단계의 추출공정등으로 시간이 소요되는 단점이 있다. 본 연구에서는 이를 상대적으로 신속히 측정할 수 있는 광간섭 biosensor를 적용코자 한다. 이 biosensor는 Si-wafer를 식각해 다공성(pore 크기: 25∼100nm)으로 만들고 다공성 표면상 부착되는 □-galactosidase의 농도에 따라 광간섭이 일어나는 현상을 이용한다. 여기에서 pore는 ethanolic HF solution의 농도, etching 시간, 또는 전류의 량에 따라서 그 size의 조절이 가능하다(6).

실험

1) Miller□s enzyme assay

Ampicillin 를 추가한 Luria-Bertani 배지를 사용하여 균주의 배양후 배지의 흡광도가 0.2에 이르면 alachlor를 첨가하였다. 30분 주기로 sample을 취해 chloramphenicol 용액을 첨가후 흡광도(600 nm)를 측정하고, sample의 일부를 Z-buffer, SDS, chloroform이 첨가된 test tube에 넣고 10초간 격렬히 교반한 뒤 ONPG를 투입하였다. 충분한 색의 변화가 일어나면 Na2CO3 용액을 첨가해 반응을 종결시키고 반응시간을 기록하였다. 혼합물을 원심분리 후 상등액을 취하여 420, 550nm에서 각각 흡광도를 측정하였다.

2) 패브리-패럿 간섭줄무늬(Fabry-Perot reflection fringe)의 측정

실험에 사용된 p-type(boron-doped, 100) Si wafer는 식각에 앞서 ohmic contact 형성을 위해 wafer 뒷면에 aluminum을 피복시킨다 (2). 만들어진 wafer는 teflon 재질의 식각기 내부에서 HF/ethanol 혼합용액으로 일정시간동안 양극식각하였다. 식각이 진행되는 동안 pore의 깊이를 고르게 하기위해 UV light (254 nm)를 조사하였다. □-galactosidase (Sigma Aldrich, Grade Ⅵ, 5,000 units)를 다양한 농도로 희석시킨 sample을 Si layer 표면에 30분간 방치 후 질소를 불어넣어 건조하였으며 CCD detector (S2000, Ocean Optics, Inc., Dunedin, Florida, U.S.A.)를 사용하여 광간섭효과를 관찰하였다.

각 sample의 측정이 끝나면 증류수와 ethanol을 사용하여 잔류효소를 최대한 제거하였고 probe의 광원을 제외한 광침투를 방지하기 위하여 암상자에서 실험을 진행하였다.

결과

1) 광간섭 바이오센서에 이용할 porous Si wafer를 위의 실험 조건에서 etching한 결과 실험에 적합한 pore size를 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

2) 저농도 □-galactosidase activity의 검출을 위해서는 광간섭을 이용한 biosensing method를 이용할 수 있다. □-galactosidase의 농도에 따라 effective optical thickness의 변화량은 sigmoid type으로 증가한다(Fig. 2).

3) E. coli ACV1003이 alachlor의 영향으로 분비한 □-galactosidase의 양이 시간에 따라 증가함을 enzyme assay를 통하여 확인할 수 있다.

Fig.. 1. SEM image of the etched surface of a Si wafer

Fig. 2. Change of □effective optical thickness

참고문헌

1. Bryan GW, Gibbs PE (1991) Impact of low concentrations of tributyltin on marine organisms, In: Newman MC, McIntosh AW eds. Metal Ecotoxicology: Concepts and Applications. Lewis Pub. Inc, Michigan, USA

2. Jobling S, Nolan M, Tyler CR, Brighty G, Sumpter JP (1998) Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32: 2498-2506

3. Walker GC (1984) Mutagenesis and inducible responses to             deoxyribonucleic acid damage in E. coli. Microbiol. Rev. 48: 60-93

4.  Heitman J, Model P (1991) SOS induction as an in vivo assay of enzyme-DNA interactions. Gene 103: 1-9

5.  Vollmer AC, Belkin S, Smulski DR, Van Dyk TK, LaRossa, RA (1997) Detection of DNA damage by use of E. coli carrying recA::lux, uvrA::lux, or alkA::lux reporter plasmids. Appl. Environ. Microbiol. 63: 2566-2571

6. H□rion, R. Properties of porous silicon; Datareview Ser. No. 18; Canham: London, 1997; pp 89-96

7. US EPA (1996) 40 CFR(Code of Federal Regulation) Part 180. Environmental Protection Agency, U. S. A.

8.  Andrease Janshoff, Keiki-pua S. Dancil, Macroproous p-type silicon Fabry-perot Layer Faberication, Characterization, and Applications in Biosensing, J. Am. Chm. Soc. 1998, 120, 12108-12116

9.  Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring    Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N. Y.