난용성 의약품의 생체이용률 증진을 위한 무정형 초미립자의 조제 (4)

: UDCA 쇄성물의 in vitro 및 in vivo 특성

김현일2, 곽성신2, 정한영2, 정해영1, 최우식1,2*

부산대학교 제약학과1*, 대학원 학과간 분체공학협동과정2

Amorphous and Nano-Particle Preparation for Improvement

of Insoluble Drugs Bioavailability (4)

: Characteristics of in vitro and in vivo of Ground UDCA

Hyun il Kim 2, , Seong Shin Kwak 2, Han Young Chung 2,

Hae Young Chung 1, Woo Sik Choi 1,2*

Depart. of Pharm. Manufac 1*., Interdisciplinary Program in Powder

Technology, Graduate School, Pusan National University 2

1. 서 언

신소재의 개발과 관련하여 submicron영역에의 초미분쇄가 최근 주목을 받고 있다. 특히 원료 의약품의 생체이용률을 증진시키기 위한 방법의 한가지로 초미분쇄 기술이 이용되고 있다1,2).

분쇄는 주로 기계적 방법에 의해 고체원료를 세분화하여, 보다 미소한 분체를 얻는 화학공학적 단위조작의 하나이다. 기계적인 분쇄는 세분화를 시도하는 것만이 아니라, 응집입자의 해쇄, 수 종류의 분체의 혼합·분산, 고체의 표면개질 또는 고체의 활성화 등의 모든 조작을 동시에 행하는 것이 많다. 특히, 미분쇄의 영역에서 그 목적하는 바는 sulfadiazole, griseofulvin, nitrofurantoin 등에서 알려진 바와 같이 입자경을 작게 함에 따라 생체이용률(bioavailability)의 향상을 꾀하는 일이다3). 또한 분쇄에 의한 의약품 원말의 미립화는 생체이용률의 향상이란 근본적인 목적 이외에도 혼합성의 개선, 함량 균일성의 향상, 유동성의 개선 등 제제 조작상의 제장애에 대처하는 면에서도 중요하다.

본 연구에서는 이전의 연구를 바탕으로 ursodeoxycholic acid(UDCA)의 in vivo 및 in vitro 특성을 평가하고, 분쇄 조제를 통한 생체이용률의 개선에 관하여 유용한 지견을 얻었기에 이에 보고한다.

2. 실험장치 및 방법

2.1. 용해도 측정

Coulter counter TAⅡ를 이용하여 일정시간 동안 용해시켜 시료의 잔류체적량을 측정하는 것으로 용해도를 계산하였다4). 측정시 용출매질은 전해질인 Isoton Ⅱ를 사용하였다. UDCA 원료 및 각 분쇄장치로부터 조제된 쇄성물을 전해질 150 □에 30 mg을 넣고 시료의 입도에 맞는 aperture tube(50, 100, 200 □)를 설치하여 평형에 도달할 때까지 일정시간 간격으로 전해질 속에 남아 있는 입자의 수를 측정하여 각 시료의 중량을 식 (1)로부터 계산하였다.

[eqn: bold { w}_{t }`` = ` { rho_s }` {pi } over {6 } ` SUM ( n_r ·bar { d`_vr^3} ` )]                               (1)

여기서, Wt는 시간 t에서 용해되지 않은 입자의 총 중량이며, □s는 시료의 밀도, nr은 측정된 입자수, dvr은 중량기준 기하평균 체적경을 나타낸다.

2.2. Cell in vitro test

항 염증 작용 실험에는 RAW264.7 cell을 사용하였으며, stimuli로 LPS 100 ng/□을 이용하였다. UDCA 원료 및 각 분쇄장치로부터 조제된 쇄성물을 2 시간 전처리하고 LPS로 자극하였다. 24 시간 후 배지를 취하여 배지 내의 NOx(NO2 and NO3)의 농도를 Griess assay로 실시하고, Griess reagent는 NO2를 발색되는 diazo 화합물로 만들어 그 양을 계산하였다.

2.3. in vivo test

UDCA 원료 및 쇄성물 200 mg/kg p.o. (CCl4-induced liver damage model) liver를 취해 5배의 homogenate buffer로 균질화 시킨 후, 900 g에서 1차 원심분리하여 핵을 떨어뜨린 다음, 다시 12000 rpm에서 2차 원심분리하여 mitochondrial fraction과 postmitochondrial fraction으로 분리하였으며, postmitochondrial fraction을 시료로 사용하였다. Reactive Oxygen Species(활성 산소종:ROS)에 DCFDA는 형광을 나타내는 물질로 바뀌므로 그 형광을 측정하여 ROS의 양 또는 활성을 나타낸다. GSH는 표준액을 만들 수 있으므로 형광치로부터 환산하여 측정하였다.

3. 실험결과 및 고찰

UDCA 원료 및 각 분쇄장치로부터 조제된 쇄성물을 Coulter counter로부터 입자의 개수를 측정하여 식 (1)에서 잔류체적량의 변화를 계산하고, 이것의 용해도 data 및 용출속도의 변화를 Table 1과 Fig. 1에 나타내었다.

Table 1 Aqueous solubility characteristics of UDCA at 20 ℃ measured by Coulter counter TAⅡ.

Data in vitro Sample			Solubility by Subtraction method (□/□)	Dissolution rate (□ /□·min)	Aperture tube
					Aperture size (□)	covering range (□)
Intact UDCA			163.31	147.04	200	4.0-80.0
Planetary ball mill	Grinding time (min)	15	170.53	169.36	100	2.0-40.0
		60	180.20	170.75	100	2.0-40.0
Vibration rod mill	Grinding time (min)	1	194.47	182.77	200	4.0-80.0
		15	199.30	195.85	200	4.0-80.0
Jet mill	Test No.	1	197.27	196.15	50	1.0-20.0
		2	196.45	196.23	50	1.0-20.0

분쇄 조제를 행한 쇄성물의 경우에 확연하게 용해도 및 용출속도가 증가함을 알 수 있었다. 이전에 보고한 연구결과에서 비정질 상태가 가장 큰 진동 로드밀로 분쇄한 쇄성물의 용해도가 가장 큰 것으로 나타났으며, 용출속도는 입자경이 작은 젯트밀 분쇄품이 초기에 빠른 용출속도를 보이고 있다.

ROS는 노화, 질환 등의 원인이 될 수 있는 것으로, 이들은 free radical의 일종으로 그 높은 반응성 때문에 축적시에는 여러 반응을 일으키는 것으로 알려져 왔다. Lipid peroxidation, protein damage, DNA damage, LDL oxidation 등이 야기되며 이러한 반응들이 축적된 것을 말한다. 그 결과를 Fig. 2(A)에 보인다. GSH는 first defense material이라 말할 수 있을 만큼 방어에 주요한 기능을 담당한다.

(A) Planetary ball mill  (B) Vibration rod mill      (C) Jet mill

Fig. 1 Solubility measurement for intact and ground UDCA

according to the  subtraction method.

즉, GSH는 어떤 손상, 주로 산화에 대해 GSSG로 작용하는 효소가 이미 존재하고 있으며, 이를 GSH 표준액을 만들어 형광치로부터 환산하여 Fig .2(B)에 나타내었다.

(A) ROS test                          (B) GSH test.

Fig. 2 The effect of UDCA on ROS generation and GSH levels of UDCA

UDCA 원료와 분쇄장치로부터 조제된 쇄성물의 in vivo 시험 대비 결과, 공격인자인 ROS level을 감소시키고, 방어인자인 GSH level은 증가시키는 작용은 쇄성물이 더 강력한 것을 알 수 있다.

항염증 작용 실험으로 측정된 NOx(NO2, NO3) 등은 reactive nitrogen speices를 형성하여 ROS처럼 여러 가지 작용을 하는 공격인자로 알려져 있으며, 그 측정 결과를 Fig. 3에 나타내었다. UDCA 쇄성물 중 특히 vibration rod mill 및 jet mill에 의한 분쇄물이 더욱 강한 작용을 나타내었다.

	Sample (A) Control, (B) LPS, (C) Intact UDCA+LPS, (D) Planetary ball mill (60 min)+LPS, (E) Vibration rod mill (15 min)+LPS, (F) Jet mill (No. 1)+LPS

Fig. 3 Anti-inflammatory effects of UDCA

4. 결 언

본 연구에서 난용성 의약품인 UDCA의 지금까지의 연구결과 분쇄 mechanism을 통해 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. Coulter counter를 이용한 용해도 측정결과에서는 비정질 상태를 보이는 진동 로드밀로 분쇄한 쇄성물이 용해도가 가장 좋은 것이 확인되었다.

2. 항염증 시험에서는 입자경이 가장 작은 젯트밀로 분쇄한 쇄성물이 NOx를 가장 적게 발생하는 것을 cell in vitro(세포 배양계에서) 시험을 통하여 확인하였다.

3. 분쇄과정을 거친 쇄성물이 in vivo 시험에서 공격인자인 ROS level은 감소시키고, 방어인자인 GSH level은 증가시키는 효과를 가져왔다.

4. 지금까지의 UDCA에 관한 연구를 종합적으로 검토해보면, 분쇄를 통한 입자경 제어 및 결정질 상태의 변화에 따라 원료 의약품의 생체이용률이 개선되는 것이 확인되었으며, 이는 다른 많은 난용성 의약품에 있어서도 분쇄 mechanism을 적용하면 Bioavailability가 충분히 개선될 것이 기대된다.

본 연구를 위해 시료를 제공해준 (주)대웅화학 김재환 사장님과 진동로드밀 분쇄를 도와준 일본 지바대학 야마모토 교수님, 젯트밀 분쇄를 도와준 일본 NPK사 야마오카씨에게 사의를 표한다.

5. 참고문헌

1). Choi, W.S., Amorphous and Nano-Particle Preparation for Improvement of Insoluble Drugs Bioavailability, The proceedings of First Asia Particle Technology Symposium(APT 2000), pp. 25, Dec. 13-15, 2000, Bankok (2000).

2). Choi, W. S., Grinding rate Improvement Using a Composite Grinding Ball Size for an Ultra-fine Grinding Mill, J. Soc. Powder Technology., Japan, 33, 747 (1996).

3). Yamamoto, K., Grinding in the Preparation of Dosage Forms, 粉□□工業  27(8), 24-29 (1995).

4). Mosharraf, M., Nystrom, C., Solubility characterization of practically insoluble drugs using the Coulter counter principle, International Journal of Pharmaceutics, 122, 57-67 (1995).

5). S. Higginbottom, C.B. Mallinson, S.J. burns, D. Attwood, S.G. Barnwell, Ursodeoxycholic acid: Effects of formulation on in vitro dissolution, International Journal of Pharmaceutics, 109, 173-180 (1994).