Cyclodextrin과 계면활성제를 이용한 astaxanthin의 가용화

김 영 범, , 이 은 규

한양대학교 화학공학과 생물공정연구실,

Solublization of astaxanthin by cyclodextrin and surfactants

Young Beom Kim and Eun Kyu Lee

Department of Chemical Engineering, Hanyang University

서론

Cyclodextrin(CD)은 6-12개의 glucopyranose분자가 1,4-glucosidic 결합에 의하여 환상으로 연결된 비환원성 oligosaccharide로 녹말을 발효시켜 얻을 수 있는 물질로 인체에 무해하다.(1) CD분자는 여러 종류의 무기물질이나 유기물질과 결합하여 포접화합물을 형성하기 때문에 휘발성 물질의 불휘발화, 산화 및 광분해의 안정화, 물리□화학적 성질의 변화 및 유화가 가능하기 때문에 식품, 의약품, 농약 분야에 도입되어 그 실용화가 확대되고 있다. 공동구조를 이루고 있는 CD는 각 glucopyranose의 외부로 노출되어있는 C2, C3, C6위치의 hydroxyl group이 친수성을 나타내는 반면 내부는 C-H결합과 glucoside의 ether결합으로 인하여 소수성을 나타내게 된다. 따라서 내부의 공동 구조에 많은 유기 또는 무기화합물들을 끌어들여 inclusion complex를 형성할수 있다.(2)

카로테노이드의 일종인 astaxanthin은 일종의 지질계통의 물질로서 분자량은 596.85 Daltons, 융점은 182-183℃이며, 불포화성 이소프렌 유도체의 일종으로 지용성 적색색소이다. 비타민 A 전구체로서의 기능과 함께 다른 카로테노이드나 토코페롤보다도 뛰어난 항산화 효과를 가지고 있으며(3), 면역증강/억제(4), 혈압강하, 소화촉진 등 여러 가지 기능성들이 밝혀지면서 식품첨가제 및 의학약품, 화장품 등의 소재로서의 활용이 기대되고 있는 물질이다.

본 연구에서는 astaxanthin을 의학약품이나 화장품등의 소재로 사용하기위하여 기존의 유기용매가 아닌 수용액에 가용화시키는 방법 및 조건의 최적화를 목적으로 cyclodextrin과 계면활성제를 사용하였다.

재료 및 방법

시약

실험에서 사용되어진 astaxanthin은 표준품(Sigma, 98% 순도, 제품번호 : A9335)을 사용하였고 inclusion complex를 형성시키기 위한 □-cyclodextrin은 Sigma사에서 구입하였고, □-cyclodextrin 유도체로 사용된 Methyl-□-cyclodextrin(RAMEB)과 Heptakis(2,6-di-o-methyl)□-cyclodextrin(DIMEB)은 각각 Sigma사와 Cyclolab에서 구입하였다.

계면활성제인 TritonX-100, Tween20, SDS는 시약급을 사용하였고 클로로포름, 메탄올 등의 시약은 HPLC급을 사용하였다.

실험기기

Inclusion complex와 micelle을 형성한 astaxanthin의 함량은 각각 UV spectrophotometer(Pharmacia Biotech, Ultrospec 2,000)와 RP-HPLC(SLC 100, (주)삼성)를 사용하였고 역상컬럼인 C18 컬럼(5□, 250 x 4.6 mm)을 사용하였다.

분석방법

Cyclodextrin과 inclusion complex를 형성한 astaxanthin의 함량을 분석하기 위하여 같은 부피의 chloroform을 첨가하여 chloroform층에 astaxanthin만을 재용해 시켜 maximum absorption을 가지는 465nm에서 흡광도를 측정하였다. 계면활성제에 의하여 micelle를 형성한 astaxanthin의 함량은 재용해 없이 465nm에서 흡광도를 측정하였다.(5) HPLC에 의한 분석은 0.2□ filter로 filtering후에 분석하였다. 완충액으로는 메탄올(100%농도)을 사용했고, 유속은 0.7ml/min를 유지하였으며 용출액의 흡광도는 465nm에서 측정하였다.

Astaxanthin-cyclodextrin inclusion complex형성

20% Methyl-□-cyclodextrin, Heptakis(2,6-di-o-methyl)□-cyclodextrin 용액을 만들고  astaxanthin 5mg을 CD용액에 넣고 밀폐한 후에 질소가스를 불어넣고 충분히 포화될때까지 교반한다(48h). 시간에 따라 sample을 100□씩 분취하여 분석용으로 준비한다.

Astaxanthin-surfactants의 micelle형성  20□/□의 농도로 chloroform에 녹아있는 astaxanthin에 Table 2와 같이 각각의 계면활성제를 첨가하고 최종 부피가 20ml이 되도록 물을 첨가하여 emulsion을 형성시킨 후 chloroform을 60℃에서 증발시켜 micelle을 형성시켰다

결과 및 토의

pH변화에 따른 complex 형성능

20%의 Methyl-□-cyclodextrin에 pH를 2에서 12까지 변화를 주고 5mg의 astaxanthin을 첨가하여 실험을 하였을 때 complex형성된 astaxanthin의 농도가 각각 10.70, 10.60□/□로 pH가 solubility에 거의 영향을 미치지 않음을 볼 수 있었다.(Fig. 1) 따라서 astaxanthin과 RAMEB사이의 반응은 이온결합이 아닌 것으로 확인되었다.

Cyclodextrin의 종류에 따른 complex 형성능

20%의 RAMEB 과 DIMEB에 5mg astaxanthin을 첨가하여 complex형성된 astaxanthin의 농도는 각각 10.80, 5.87□/□로 RAMEB를 사용하였을때가 약 2배정도 형성능이 높음을 알 수 있었다.(Table 1)

온도 및 CD 대 astaxanthin의 몰 비율 변화에 따른 complex 형성능    같은 농도의 cyclodextrin용액을 사용하였을 때 온도를 올릴수록 좀더 많은 양의 complex를 형성하는 현상을 보였고. cyclodextrin용액 속으로 들어가는 astaxanthin의 양을 급격히 증가시켰을 경우에 solubility도 함께 증   가 됨을 알수 있었다. 그러나 투입된 양에 비하여 complex를 형성하는데 사용된 양을 비교 하였을 때 그 양은 감소함을 보였다.

또한 질소가스를 불어 넣어주었을 때 좀더 높은 complex 형성능을 보임을 알 수 있었다.(Table 1)

계면활성제에 의한 micelle 형성능

20□/□의 농도로 chloroform에 녹아있는 astaxanthin에 Table 2와 같이 각각의 계면활성제를 첨가하고 최종 부피가 20ml이 되도록 물을 첨가하여 emulsion을 형성시킨 후 chloroform을 60℃에서 증발시켜 micelle을 형성시켰다. Tween20을 사용하였을 때 약 14□/□로 가장 높은 micelle 형성능을 보임을 알 수 있었다(Table 2의 # 2, 6, 9 참조). 그러나 Tween-20이 SDS, □-CD와 혼합되었을 때에는 micelle의 크기가 커져서 여과액내의 색소농도는 낮았다(# 11).

결론 및 계획

Cyclodextrin을 사용하여 astaxanthin을 수용액상에 가용화 시키는 실험을 여러가지 조건에 변화를 주면서 실험한 결과로써 RAMEB이 DIMEB보다 complex 형성능이 더 좋았고, 온도를 높일수록, 반응하는 astaxanthin농도가 높을수록 complex 형성능이 증가됨을 알 수 있었다. 그러나 총 astaxanthin에 대한 complex를 형성한 astaxanthin의 양은 25℃에서 4.32%에 불과 하였다.

이는 astaxanthin의 크기가 cyclodextrin의 cavity 부피보다 커서  complex를 형성할 수 있는 한계를 넘기 때문인 것으로 생각된다.

이에 반하여 계면활성제를 이용한 micelle 가용화 시켰을 때는 Tween20의 경우70%정도의 가용율을 보였다. 앞으로의 실험의 방향은 유기용매를 완전대체할 수 있는 micelle 수용액시스템을 개발하는데 있다.

참고문헌

1. T. Loftsson and M. E. Brewster (1996), Pharmaceutical  Applications     of Cyclodextrins. 1. Drug Solubilization and Stabilization, J. of           Pharm. Sci. Vol. 85, No. 10

2. J. Szejtli(1993), Cyclodextrins in Pharmacy, pp. 1-18, Kluwer            Academic Publishers, Dordrecht.

3. J. Tera (1989), Antioxidant Activity of □-Carotene-Related               Carotenoid, Pure & Appl. Chem., 63, 141-146

4. A. Bendich(1989), Carotenoids and the immune system in                "carotenoids", Plenum press, New York, 323-335.

5.  L. Szente, K. Mikuni, H. Hashimoto and J. Szejtli (1998),                Stabilization and Solubilization of Lipophilic Natural Colorants with      cyclodextrins. Journal of Inclusion Phenomena  and  Molecular in      Chemistry 32, 81-89

Fig. 1. solubility of astaxanthin in different pHs

	Astaxanthin(mg)	20% cyclodextrin (20ml)	Temperature (℃)	Complexed astaxanthin(□ / □)	Solubilizationyield(%)
1	5	RAMEB	25 (air)	1	0.4
2	5	RAMEB	65 (air)	6.20	2.48
3	5	RAMEB	25 (N2)	10.80	4.32
4	5	RAMEB	65 (N2)	28.72	11.49
5	5	DIMEB	25 (N2)	5.87	2.35
6	500	DIMEB	25 (N2)	213.70	0.86

Table 1. Astaxanthin-cyclodextrin inclusion complexing ability

	Astaxanthin (20□/ml) in CHCl3 (ml)	50% TritonX-100 (ml)	50% Tween20 (ml)	10% SDS (ml)	□-CD (g)	H2O (ml)	Solublized astaxanthin (□/ml)	Solubilization yield (%)
1	10	2				8	7.96	38
2	10		2			8	13.90	69.5
3	10			2		8	1.26	6.3
4	10				0.1	10	0	0
5	10	2			0.1	8	8.03	40.15
6	10		2		0.1	8	13.70	68.5
7	10			2	0.1	8	0	0
8	10	2		2		6	9.14	45.7
9	10		2	2		6	14.05	70.25
10	10	2		2	0.1	6	6.81	34.05
11	10		2	2	0.1	6	3.32	16.6

Table 2. Emulsification and micellization