동시당화추출발효를 이용한 섬유성바이오매스로부터의

초산생산공정

박준호, 우창호, 최실호, 윤현희

경원대학교 화학공학과

Simultaeneous Saccharification and Extractive Fermentation of

Cellulosic Biomass  for Acetic acid Production

Chun Ho Park, Chang Ho Woo, Sil Ho Choi, Hyon Hee Yoon

Department of Chemical Engineering, Kyungwon University

서론

공업용 acetic acid는 화학적 합성 또는 미생물 발효에 의하여 생산된다.[1] 화학합성공정의 문제점은 천연가스 등의 석유자원을 원료로 사용하고 다량의 환경오염물질을 배출하는 것이다. 이에 반하여, 미생물 발효에 의한 acetic acid 생산공정의 장점은 매년 재생산되는 생물자원을 원료로 사용하고 오염물질의 배출이 작다는 것이다. 특히 최근에 관심이 모아지고 있는 homoacetate 균주를 이용한 발효공정은 육탄당(glucose, fructose) 및 오탄당(xylose)을 포함한 다양한 기질을 높은 수율(이론수율 100%)로서 acetic acid로 전환할 수 있다[2].

본 연구에서는 대체원료로 섬유성바이오매스를 사용하여 acetic acid를 생산하는 공정을 조사하였다. 섬유성바이오매스로부터 acetic acid를 생산하는 공정은 cellulase 효소를 이용한 당화(enzymatic saccharification)와 acidogenic bacteria를 이용한 혐기성 발효공정으로 구성된다. 동시당화발효(SSF)는 이와 같은 효소당화와 발효공정을 동시에 한 개의 반응기 안에서 수행하는 것으로 SSF공정의 장점은 cellulase 효소에 대한 glucose의 저해작용를 최소화하여 효소당화 속도가 증대되고 따라서 고가의 효소사용량을 줄일 수 있다는 것과 공정이 단순화된다는 것이다[3]. 그러므로 SSF공정이 효과적인 초산생산공정이 되기 위해서는 효소당화와 미생물발효가 동시에 진행되어야한다. 그러나 □-cellulose를 기질로한 SSF실험에서, 생성물인 초산이 초산균주와 동시에 효소에 대한 저해작용을 일으켜 생산성이 낮아지는 것을 관찰하였다. 또한 회분식 SSF에서 초기 균주의 성장지연으로 인하여 효소당화에서 생성된 glucose의 소모가 느리게 진행되었고, 전체적으로 glucose의 농도가 낮은 상태에서 진행되는 SSF의 특징이 나타나지 않았다. 따라서 본 연구에서는 생성물인 초산의 저해작용을 검토하고 유가식 발효실험을 수행하였으며, 이온교환수지를 이용하여 SSF 반응도중에 초산을 분리 제거하는 동시당화추출발효(Simultaneous Saccharification and Extractive  Fermentation, SSEF)을 수행하여 그 성능을 조사하였다.

재료 및 방법

효소 및 균주 : 효소는 Trichoderma reesei 변이균주에 의해 생산된 상업용 효소인 Celluclast 1.5L과 중성효소인 Novozym 342를 사용하였다. 균주는 동결 건조된 Moorella thermoacetica (Clostridium thermoaceticum, ATCC 49707)를 American Type Culture Collection으로부터 분양 받아 Reinforced Clostridial Medium에 적응 배양시킨 후 acetate에 대한 내성을 높이기 위해서 3% sodium acetate가 첨가된 배지로 3일마다 계대배양하였다.

발효배지: 발효배지조성은 ① 5 g/L Yeast extract, ② Phosphate solution [9 g/L KHCO3, 1.4 g/L K2HPO4, 1.1 g/L KH2PO4], ③ Salt solution [1g/L (NH4)2SO4, `0.25 g/L MgSO4·7H2O, 0.04 g/L Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O, 0.03 g/L CoSO4·7.5H2O, 0.0033 g/L Na2WO4·2H2O, 0.0024 g/L Na2MoO4·2H2O, 0.00024 g/L NiCl2·6H2O, 0.00029 g/L ZnSO4·7H2O, 0.000017 g/L Na2SeO3, 0.1% Resazurin indicator 1ml/L], ④ 0.25 g/L Cysteine·HCl·H2O, ⑤기질[glucose 또는 □-cellulose]이다. 종배양은 10ml의 배지를 포함하는 15 ml시험관에 균주를 접종하여 55℃, 120rpm에서 36시간동안 배양하였다. 전배양은 250ml의 삼각플라스크에서 90ml의 배지에 10ml의 종배양액을 접종하여 55℃, 120rpm에서 48시간 동안 배양하였다. 본 발효는 1.5L New Brunswick, Bioflo Ⅲ에서 전배양액 10%를 접종하고 CO2 가스를 주입시키면서 수행하였다.

동시당화발효(SSF): SSF 배지의 조성은 초산발효배지와 같고 단지 glucose 대신에 □-cellulose를 기질로 사용한다. 배지 900ml에 100ml의 전배양액(초산발효실험과 동일)과 당화효소(45 IFPU/g cellulose)를 첨가하여 SSF 실험을 수행하였다. 이때 사용한 반응기는 1.5L New Brunswick, Bioflo Ⅲ 이며, 200rpm으로 72∼120시간 배양하였다. pH 조절은 5N NH4OH용액을 사용하였다. 유가식 SSF실험에서는 회분식 SSF를 통해 기질 투입시기를 결정하여 기질을 1% (w/v)씩 투입하였다. 이온교환수지(Amberlite IRA-400)를 이용한 SSEF실험은 발효조에 200g/L의 수지를 첨가한 후 SSF와 같은 방법으로 수행하였다.

분석: 유기산(acetate) 및 당성분(glucose, cellobiose, xylose)은 HPLC와 효소법(영동제약 포도당 측정용 시약)으로 분석했다. HPLC(Waters 2690) isocratic mode에서 BioRad HPX-87H column을 사용하였으며 이동상은 0.005M H2SO4이었으며 column 온도는 65℃ 이었고 유속은 0.6 ml/min 이었다.

결과 및 토론

초산발효

본 실험에 사용한 혐기성 초산균주의 적절한 온도는 60-55℃이며 pH는 7.0-6.0이었다. 그러나 pH 5.0이하에서는 미생물의 활동이 현저히 감소되는 것을 관찰하였다. Fig. 1은 전형적인 혐기성초산발효 실험결과를 나타낸 것으로, 균주의 성장과 초산생성곡선으로부터 초산생성이 성장관련인 것을 알 수 있었다.

효소당화

초산발효의 적절한 온도 및 pH 조건과 유사한 범위에서 활성을 갖는 섬유소 당화효소를 탐색하였다. Fig. 2는 Celluclast 1.5L과 Novozym 342를 사용하여 □-cellulose의 당화실험을 수행한 결과로서, 반응온도 및 pH에 따른 digestibility를 나타낸 것이다. 본 실험의 범위에서(온도 50-55℃, pH 5.0-6.5), Celluclast 효소는 낮은 온도(50℃)와 낮은 pH에서 높은 활성을 나타내었다. 반면에 Novozym 342 효소는 pH의 영향이 미미하였다. 그러나 전반적으로 Celluclast 효소의 활성이 Novozym 342 효소에 비하여 우수한 것으로 나타났다. Celluclast 효소의 최적 pH와 온도는 각각 pH 4.8∼5.0, 50℃ 이었다. 그러나 초산발효와 근접한 조건을 고려하면 pH 5.5와 55℃(초산발효의 경계조건)에서 SSF를 조업시키는 것이 타당할 것으로 판단할 수 있다.

동시당화발효(SSF)

Glucose를 기질로한 초산발효실험과 효소당화실험에서 관찰한 반응온도 및 pH 조건을 고려하여 결정한 55℃와 pH 5.5에서 회분식 SSF실험을 수행하였다. Fig. 3에 나타난바와 같이, SSF의 초기에는 glucose 축적이 상당량 있는데 이는 초기 SSF에서 균주의 성장지연으로 인하여 glucose의 소모가 느리게 진행되었기 때문이다. 이후에는 glucose의 생산속도가 전체 공정의 속도결정단계가 되었다. SSF 반응 48시간 이후부터는 glucose의 농도가 거의 영으로 효소당화가 율속단계이었지만, 전체적으로 glucose의 농도가 낮은 상태에 진행되는 SSF의 특징이 나타나지 않았다. 사실 이 결과는 SSF 결과라기보다는 효소당화와 발효를 분리시킨 결과와 유사하다고 볼 수 있다. 따라서 본 SSF 조업조건에서 미생물의 활동이 제약을 받는 것으로 판단된다.

균주의 성장지연을 최소화시켜 SSF의 효과를 관찰하기 위하여 유가식 SSF 실험을 수행하였다. 유가식 SSF의 기질투입은 회분식 SSF의 결과를 고려하여 최초 투입한 기질의 반응이 거의 종결되는 48시간이 지난 후에 24시간마다 1%(w/v)의 기질을 간헐적으로 투입하는 방법을 사용하였다. 이 때 효소의 역가는 50 IFPU/g-cellulose를 유지하였으며 mineral과 yeast extract는 1X배로 보충하였다. Fig. 4에 나타난 바와 같이 효소에 대한 glucose의 저해가 상당히 해소되었으며 glucose 농도가 회분식 SSF에 비하여 낮게 유지되었다. 반응 144시간에서 24.4g/L의 acetic acid를 얻을 수 있었고 acetic acid 수율은 회분식 SSF에서의 acetic acid 수율 51%에 비해 61%로 증가하였다. 이 실험을 통하여 초산균주가 발효배지에 적응이 된 후에는 25g/L이상의 acetic acid 농도에서도 활성을 유지한다는 것을 알 수 있었다. 그러나 유가식 SSF 반응에서 초산생성속도가 반응시간에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 즉 초산농도의 기울기가 시간에 따라 감소하였다. 이것은 최종생산물인 acetic acid가 초산균주뿐만 아니라 효소에도 저해작용을 하기 때문이다. 따라서 SSF를 효과적으로 수행하기 위해서는 SSF 도중 생성된 초산을 분리제거하는 공정이 필요한 것으로 판단된다.

동시당화추출발효

Fig. 5는 Amberlite IRA-400 이온교환수지의 흡착성능을 나타낸 것이다. Acetic acid 흡착능이 83mg/g dry resin으로 나타났으며 pH가 높을수록 흡착성능이 더 높아지는 경향을 나타내었다. SSF용액에 멸균된 IRA-400 이온교환수지를 첨가하고 SSEF 실험을 수행한 결과를 Fig. 6에 나타내었다. 120시간에서의 발효액 중의 acetic acid 농도가 12.1g/L이었고, IRA-400 수지 중에 있는 acetic acid의 농도는 2.5N HCl 용액으로 탈착시켜 측정한 결과 11.8g/L이었다. 따라서 전체 초산의 농도는 23.9g/L로 60%의 수율을 보였으며 초산생산성은 단순 유가식 SSF 공정의 0.15g/L-hr 보다 향상된 0.20g/L 이었다.

참고문헌

[1] Agreda, V.H., Zoeller, J.R., "Acetic Acid and Its derivatives", Marcel Dekker , Inc., N.Y., N.Y. (1993)

[2]  Borden, K.J., Master's Thesis, Auburn University (1999)

[3] Takagi, M., Abe, S., Suzuki, S., Emert, G. H., and Yata, N.: in Proceedings of the Bioconversion Symposium, IIT, Delhi, Ghose, T. K., ed., 551(1977).

감사 : 본 연구는 경원대학교 교내연구비에 의하여 수행되었습니다.

Figure 1.Typical acetic acid fermentation by C thermoace-

ticum Operating conditions pH

6.5, 55℃, 20 g/L glucose.

Figure 2. Effects of pH and      temp. on the enzymatic diges-

tibility

Figure 3. Batch SSF with        2wt% □-cellulose at pH

5.5, 55℃.

Figure 4. Fed-batch SSF     with □-cellulose at

55℃ and  pH 5.5.

Figure 5. Adsorption isothe-

rm for acetic acid using        IRA-400 resin at 40℃.

Figure 6. SSEF using Amber-

lite  IRA-400 resin at 55℃,     pH 5.5.