Streptomyces griseus HUT 6037 키토사나제의 순수 키토산 가수분해에 의한 키토올리고당 생성 효과

김선영, 손정우, 이천우, 김광

동아대학교 공과대학 화학공학과

The producing effect of chitooligosaccharides of pure chitosan by enzymatic degradation with chitosanase from Streptomyces griseus HUT 6037

Sun-Young Kim, Jeong-Woo Son, Cheon-Woo Lee, Kwang Kim

Dept. of Chem. Eng., Dong-A Univ.

서론

Chitin, chitosan은 분자구조가 거의 유사한 다당류로서 피라노스환의 2위의 탄소에 N-아세틸기를 가진 chitin과 아미노기를 가진 chitosan으로 구별된다. 그러나 이러한 작용기가 100 % 결합되어 있는 것이 아니고 일반적으로 혼재되어 있는 것으로 알려져 있다.[1] Chitin과 chitosan은 모두 고분자의 형태로 의용재료, 수처리 응집제, 식품재료등에 이용되고 있으며, 특히 chitosan을 가수분해한 저분자 물질인 chitooligosaccharide중에서 단당류인 Glucosamine은 감미제, 조미제, 의약원료로 사용되고[2], (GlcN)2∼(GlcN)5은 일반세균에 대한 항균성, 유산균에 대한 증식촉진효과등이 있으며, (GlcN)6은 면역증활효과, 항종양활성등의 효율성의 가치가 주목되고 있다[3]. 2-amino-2-dioxy-□-D-glucose를 주 구성 단위로 하는 이 chitosan은 아질산, 염산, 과산화수소, 과옥소산 등의 화학적 방법으로 저분자화가 가능하지만 99 %이상의 탈아세틸화된 chitosan(pure chitosan)의 효소적 가수분해에 의해 중합도 2∼5의 chitooligosaccharide을 고수율로 얻는 것이 가능하고[4], 그 중 Streptomyces griseus HUT 6037과 Bacillus circulans MH-K1에서 생성된 chitosanase는 부분적으로 탈아세틸화된 chitosan을 가수 분해하여 GlcN- GlcNAc의 결합뿐 아니라 GlcN-GlcN의 결합을 가수분해하여 Glucosamine, N-acetyl glucosamine 또는 hetero chitooligosaccharide를 생성시킬수 있다고 보고되었다[5].

본 연구에서는 효소의 chitosan 가수분해에 의한 chitosan chitooligo- saccharides의 효율적인 생산을 위해 Streptomyces griseus HUT 6037로부터 발현된 chitosanase를 사용하여 몇가지 농도구배를 가지는 chitosan 용액과 반응시켜 생성되는 chitooligosaccharides의 양을 분석하여 반응성이 가장 높은 것을 찾고자 하였으며, 효소의 활성범위에 따른 가수분해 효과, 그리고 반응 시간에 따라 생성되는 chitooligosaccharides의 조성을 HPLC 분석하여 필요로 하는 당을 생산하기 위한 반응조건을 알아내고자 하였다.

실험

1. 미생물 배양

본 연구에 사용된 미생물은 Streptomyces griseus HUT 6037이며 chitin과 chitosan을 분해하는 효소인 chitinase 및 chitosanase를 발현하는 특성을 가지고 있다. 균주는 mannitol 1.0 %, polypeptone 0.2 %, yeast extract 0.1 %, meat extract 0.1 %를 포함하는 액체배지 50 mL에 접종하여 250 mL Erlenmeyer flask에서 pH 7.0, 30℃로 48 hr동안 연속적으로 계대 배양하였다.

2. 효소생산

미생물 배양액 1 mL를 KCl 0.05 %, K2HPO4 0.1 %, MgSO4·7H2O 0.05 %, FeSO4 0.001 %, chitosan 0.5 %를 포함하는 효소배지 50 mL에 접종하여 250 mL Erlenmeyer flask에서 pH 7.0, 30 ℃로 96 hr동안 배양하였다. 배양액은 원심분리하여 기질을 제거한후 에탄올로 효소를 침전시켜, 원심분리하고 상층액을 제거한 뒤 침전물을 0.1 M phosphate buffer pH 7.5에 용해시켜 chitosanase를 얻어내었다.

2. Chitosanase 활성측정

Chitosanase의 활성은 효소 1 mL, 0.1 M phosphate buffer(pH 7.5) 2 mL, 그리고 2 % glycol chitosan 1 mL를 37 ℃에서 10분간 항온시킨 후 유리되어진 아미노당을 Rondle과 Morgan의 방법에 따라 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 효소의 활성 1 unit는 37 ℃에서 1분동안 기질로부터 아미노당 1□mol을 가수분해하는 양으로 하였다.

3. Chitosanase의 기질 특이성

기질로서 각각 0.24 %와 0.36 %의 99 % chitosan, glycol chitosan, 그리고 CM-chitosan 용액(1mL)을 사용하여 37 ℃에서 연속적으로 chitosanase (0.125 Units/0.5mL)와 반응시켜 시간에 따라 생성된 올리고당의 □mole수를 Schales의 방법에 따라 측정하였다[6].

4. Chitosanase에 의해 생성된 chitooligosaccharides의 분석

Chitosanase에 의해 생성된 chitooligosaccharides는 기준용액으로 (GlcN)1-6을 사용하여 □Bondapak NH2 칼럼이 부착된 HPLC로 Refractive Index를 사용하여 분석하였으며, 이동상으로는 55 % acetonitrile 용액을 사용하였다.

결과 및 토론

Pure chitosan을 기질로 선택하여 0.24%, 0.36%, 0.48%, 0.60%의 농도구배를 두고 Chitosanase (0.25Units/0.5mL)로 기질과 반응하여 시간에 따른 환원당의 양을 구하여 생산능력을 측정하였다. Fig. 1.에서 보는 바와 같이, 같은 기질을 사용하더라도 높은 농도(0.60%)의 기질에서 올리고당의 가수분해가 더 잘 일어나고, 반응을 종결한 180분에서 농도가 0.24%일 때는 2.14□mole/mL, 0.60%일 때는 2.99□mole/mL의 올리고당이 생성되었다. 위 실험의 결과로 가장 가수분해율이 높은 0.60% 농도의 기질을 다양한 범위의 chitosanase와 반응시킴으로 기질의 농도에 따른 적합한 효소활성을 결정하려 하였다. Fig. 2.에서 보이는 것과 같이 0.12Units의 chitosanase가 가장 높은 가수분해능을 보이고, 이를 중심으로 그 이상과 이하 Units의 chitosanase는 가수분해능이 떨어지는 것이 관찰되었다. 반응을 종결시킨 360분에서 0.12Units의 chitosanase는 5.26□mole/mL의 환원당을 생성하였고, 0.012Units와 0.24Units의 chitosanase는 각각 2.48□mole/mL, 3.56□mole/mL의 환원당을 생성하였다. Fig. 3.에서는 각 시간대별로 나온 효소와 기질반응의 결과를 60분으로 환산했을 때의 환원당의 생성량을 나타냈으며 반응시작 10분 동안에 0.16Units의 chitosanase를 사용하였을 때 9.80□mole/mL의 가장 많은 환원당을 생성할 수 있음이 계산되었다. 가수분해 결과 생성된 환원당은 HPLC로 분석하였고, 그 결과를 Fig. 4.에서 나타내었다. chitooligosaccharide 1∼6당 혼합물을 standard로 사용하여 분석한 결과 가수분해에 의해 (GlcN)2, (GlcN)4, (GlcN)6이 생성되었음을 알 수 있었다.

이상의 결과들로 볼 때 chitosanase의 기질농도에 따른 효소적 가수분해 반응은 기질을 0.6%의 chitosan을 사용하였을 때 가장 많은 환원당을 생성하여 가장 적합한 농도로 결정이 되었으며 앞으로 그 이상의 기질 농도에 대한 실험으로 이상의 결과를 검증하는 것이 필요하다고 생각된다. 또한 이 농도의 기질에 대해 0.12Units의 chitosanase가 가장 높은 효소 가수분해 효과를 나타내었는데, 앞으로 기질의 농도에 대한 최적 효소 Unit를 결정하는 연구도 이루어져야 한다. 이 효소·기질 반응에서 2, 4, 6당의 chitooligosaccharide가 생성되었으며 2시간 이내의 반응에서 당의 생성효율이 가장 높은 것으로 생각되어 진다. Table 1.에서 0.60%의 기질에 대한 각 Units별 상대 환원당 생성량과 가수분해속도를 나타내었다.

참고문헌

[1] Chen, J. P., and M. S. Lee, Enhanced production of Serratia marcescens chitinase in PEG/dextran aqueous two-phase systems, (1995), Enzyme Microb, Technol, 17, 1021-1027

[2] Asano, S., (1985), Polymer Digest, 2, 10-17

[3] 坂井和男,  (1989), New Food Industry, 31(6), 17

[4] 相羽誠一, 키틴, 키토산의 화학반응성, (1990), 섬유와 공업, vol. 46, No. 12

[5] Mitsutomi, M., Ueda, M., Arai, M., Ando, A., and Watanabe, T., Action pattern of microbial chitinases and chitosanases of partially N-acetylated chitosan, (1996), Chitin Enzymology, vol. 2, 273-284

[6] Mitsutomi, M., Hata, T., and Kuwahara, T., Purification and characteri- zation of Novel chitinases from Streptomyces griseus HUT 6037, (1995), Ferment. Bioeng., 80, 153-158

Table 1. Heterogeneous degradation of 0.6%(w/v) pure chitosan with various ranges of chitosanase from Streptomyces griseus HUT 6037 at the final stage of reaction

Enzyme activity [unit/mL]	Amount of reducing sugar [mg] (%(w/v))	Relative hydrolysis rate [%]
0.24 0.16 0.12 0.10 0.05 0.024 0.012	30.67(17.03) 40.12(22.29) 45.38(25.21) 37.28(20.71) 33.32(18.51) 22.33(12.40) 21.47(11.93)	67.58 88.41 100.00 82.16 73.43 49.20 47.30

Fig. 1.	Amount of reducing sugar by heterogeneous hydrolysis of chitosans with various range of concentrations by chitosanase from Streptomyces griseus HUT 6037		Fig. 2.	Amount of reducing sugar by heterogeneous hydrolysis of chitosan with various units of chitosanase from Streptomyces griseus HUT 6037

Fig. 3.	Amount of reducing sugar by heterogeneous hydrolysis in specific time(1hr) with various units of chitosanase from Streptomyces griseus HUT 6037		Fig. 4.	HPLC of chitooligosaccharides obtained by hetero geneous hydrolysis of pure chitosan(0.6%) with chitosanase(0.12 Units/mL). Samples were loaded separately onto □Bondapak NH2 column and eluted with acetonitrile-water (55:45). Detector : Refractive Index. Standard : (GlcN)n (n=1∼6)