공유결합으로 고정화된 Urokinase를 이용한

융합단백질 절단반응으로 rhGH 생산

서창우, 1강관엽, 1이효실, 2안상점, ↕이은규

한양대학교 화학공학과 생물공정연구실

1(재)목암연구소 단백질 연구실, 2(주)녹십자 GE팀

Production of rhGH from Fusion Protein Cleavage

by Covalentley Immobilized Urokinase

Chang Woo Suh, Kwan Yub Kang1, Hysil Lee1, Sang Jum Ahn2

and Eun Kyu Lee↕

Bioprocessing Research Laboratory, Department of Chemical Engineering, Hanyang University,

1Protein Laboratory, Mogam Biotechnology Research Insitute

2Genetic Engineering Team, Korea Green Cross Corp.

서   론

재조합 단백질의 생산 기술의 발달로 많은 수의 사람단백질이 대장균이나 효모를 통해 생산되고 있다. 특히 목적단백질이 융합단백질의 형태로 발현하는 경우가 증가하고 있다. 이러한 경우 융합단백질에서 목적단백질만을 절단하여 얻어내는 공정이 필요하다. 기존의 공정은 절단효소를 사용하여 대부분 회분식 공정으로 처리하고 있다. 이 경우 효소의 회수 및 재사용이 어려워 산업적 규모에서는 효소의 비용이 생산공정에서 큰 부분을 차지하게된다. 따라서 고정화 효소반응을 도입함으로써 효소의 재이용과 반응 후 회수 및 정제공정이 용이하여 경제적인 공정구축이 가능해진다.

본 연구에서는 절단효소를 고정화하여 연속반응 공정과 반복사용을 가능하게 하고 고정화 UK를 이용하여 융합단백질(hGH-GST)로부터 인성장호르몬(hGH)을 절단하여 얻는 공정을 대상으로 하였다. 사용된 절단 효소인 urokinase(UK, EC 3.4.21.31)는 plasminogen 활성제로 411개의 아미노산으로 이루어져 있는 serine protease의 한 종류이다(1). 또한 절단반응에서 회분식 반응기와 컬럼식 연속반응기의 장단점을 비교하고 고정화 효소의 재사용을 위한 방법에 중점을 두고 수행하였다.

재료 및 방법

실험재료

본 실험에 사용된 UK와 융합단백질(hGH-GST)는 (주)녹십자로부터 제공받았으며 UK는 352,000 IU/ml의 활성을 가지고 있다. Sepharose CL-6B는 Amersham Pharmacia Biotech사에서 구입하였고 gel 활성물질로 사용된 glycidol (2,3-epoxy -1-propanol), sodium periodate, sodium borohydride 등의 시약들은 모두 Sigma에서 구입하였다. 효소활성 측정을 위한 기질인 ALMe(N-□-acetyl -L-lysine methyl ester hydrochloride)와 perchloric acid, chromotropic acid 등의 시약들 역시 Sigma에서 구입하여 사용하였다.

Sepharose gel의 활성화

Sepharose gel을 glycidol을 사용하여 etherification시키고 산화제인 periodate (NaIO4)을 사용하여 oxidation시켜 활성화하였다. 이렇게 활성화된 bead의 알데하이드기는 단백질의 아민기와 공유결합반응을 일으킨다.

UK 효소역가분석  액상과 고정화된 UK의 활성 측정은 모두 Esterolytic 방법을 사용하였다(2). UK 역가의 단위는 CTA unit(= I.U.)을 따랐다. 실험에 사용된 UK 표준물질은 (주)녹십자로부터 제공받았다.

융합단백질 절단반응 평가

융합단백질은 절단되어 목적단백질인 hGH와 GST절편으로 분리되어진다. 융합단백질의 절단정도는 반응에 투입된 융합단백질의 질량 대비 절단된 융합단백질의 질량을 비교함으로 평가하였다.

결과 및 토의

Sepharose gel의 활성화

Gel 표면의 활성화 정도는 초기 etherification 단계에서 glycidol의 농도에 따라 변화하는 것으로 나타났다. Fig. 1에서 glycidol의 농도를 0.2M에서 2.0M로 변화시키면서 gel 표면을 활성화시켰을 때 단위 ml gel 당 glyceryl의 농도는 7□M에서 30□M까지 선형적으로 변화하였다.

UK의 고정화

UK의 고정화는 30분 이내의 빠른 반응속도을 보이나 고정화된 UK의 활성은 7시간 이후 급격히 높아져 초기 활성의 80%를 나타내었다(Fig. 2). 이때 UK의 고정화 정도는 99% 이상을 유지하는 좋은 결과를 얻을 수 있었다.

고정화 UK의 특성

고정화 효소의 안정성을 측정하기 위하여 37℃에서 24시간 방치 후에 효소의 활성을 측정하였다. 이때 고정화 UK는 98%의 활성을 유지한 반면 액상 UK는 65%의 활성만을 유지하였다. 또한 pH의 안정성을 측정한 결과 낮은 pH에서 액상 UK 대비 10% 이상 높은 활성을 나타내었다.

고정화 UK의 컬럼 반응기에서의 연속식 절단반응

컬럼 반응에서는 기질의 유입속도에 따라 절단반응수율이 크게 변화하기 때문에 먼저 유속에 따른(0.1 - 12 bed vol./h) 절단반응수율을 측정하였다. 유속변화에 따라 13%에서 61%까지의 다양한 절단수율을 얻을 수 있었다.

Expanded bed adsorption 크로마토그래피를 이용한 hGH 단량체의 분리

고정화 UK를 이용한 융합단백질의 절단반응 후에는 미반응 융합단백질과 목적단백질인 hGH 그리고 GST 단편이 함께 용출된다. 이러한 혼합물에서 목적단백질만을 분리하는 방법으로 산침전법을 사용하였다.

산침전 후에 원심분리를 통한 분리방법은 공정이 수작업화되고 목적단백질이 외부에 노출되어 오염될 위험이 있어 hGH와 같은 의약용 단백질의 생산에는 적합하지 못하다. 따라서 침전물을 제거하는 공정으로 expanded bed adsorption 크로마토그래피(StreamlineTM, Amersham Pharmacia Biotech)를 도입하였다(3, 4). Fig. 3의 결과를 보면 컬럼을 통과 후의 미흡착 용출액을 원심분리후 상층액과 침전물을 분석한 결과 상층액에는 아무런 단백질도 검출되지 않았다. 흡착된 단백질을 1M의 NaCl로 용출시켜 분석한 결과 100%의 hGH만이 존재하였다. 따라서 Streamline을 포함한 공정에 의해 융합단백질의 절단, 침전에 의한 불순물 분리, 침전물 분리 및 hGH의 정제 등의 다단계 공정을 통합시켜 운영할 수 있게 하였다.

고정화 UK의 풀림과 재접힘을 통한 반복사용

고정화 효소를 이용한 반응은 절단반응이 지속되면서 효소의 활성이 여러요인에 의해 감소하게 된다. 활성감소를 다시 회복하기 위한 방법으로 solid state refolding 방법을 도입하였다. 고정화 효소에 변성제(6M GuHCl)를 사용하여 고정화된 효소를 풀린 구조로 변환시킨 후에 변성제를 서서히 제거함으로 재접힘을 유도하였다(5, 6). 이러한 재접힘을 통해 gel내의 이물질 제거와 함께 원래의 효소활성을 가진 3차원적 구조를 얻고자 하였다. 1시간동안 재접힘을 유도한 후의 효소활성은 초기의 98%까지 회복되었다(Fig. 4). 이러한 재접힘을 통한 효소의 재생을 연속적으로 수행함으로써 경제적인 공정구축이 가능해진다.

참 고  문 헌

1. Harris, Y. J., Second-generation plasminogen activators, Protein Engineering, 1(6), 449-458 (1987).

2. Barlow, G. H.,  Urinary and kidney cell plasminogen activator (urokinase), Methods in Enzymology, 45, 239-244 (1976).

3. Wright, P. R., F. J. Muzzio, and B. J. Glasser, Effect of Resin Characteristics on fluidized Bed Adsorption of Proteins, Biotechnol. Prog., 15, 932-940 (1999).

4. Frej, A. B., R. Hkorth, and A. Hammarstrom, Pilot Scale Recovery of Recombinant Annexin V from Unclarified Escherichia coli Homogenate Using Expanded Bed Adsorption, Biotech. Bioeng., 44, 922-929 (1994).

5. Soler, G., A. Bastida, R. M. Blanco, R. Fernandez-Lafuente, and J. M. Guisan, Reactivation strategies by unfolding/refolding of chymotrypsin derivatives after inactivation by organic solvents, Biochinica et Biophysica Acta, 1339, 167-175 (1997).

6. Nohara, D., H. Sakakibara, E. Kurimoto, T. Hayashi, and T. Sakai, A new method of media selection for protease refolding by application of immobilized Subtilisin preparoation, J. Ferm. Bioeng., 82(3), 315-318 (1996).