CaCO3 표면의 단백질 흡착에 따른 계면전동에 관한 연구

용동희 , 신나영 , 최청송

서강대학교,화학공학과

Study on Electrokinetic Properties of the protein

adsorbed on CaCO3

Dong-hee Yong , Na-young Shin , Cheong-song Choi

Department of chemical engeering, Sogang university

서론

생물학적으로 형성된 생체복합재는 대부분 무기물과 유기매트릭스로 이루어졌으며 성장환경에 따라서 고유의 결정구조 특성 ,형태 및 기계적 강도등이 조절된다. 연체 동물의 패각과 척추 동물의 수산화인회석은 유사한 기능을 지니는 골격의 구성인자이며 biomoneralization을 통해 이러한 기관이 형성될 때 가장 중요한 인자로 인식되는 것은 유기 매트릭스이다. 유기 매트릭스는 주로 결정내부단백질과 다당류로 이루어졌으며 패각조직을 형성할 때, 무기물의 구조와 형태특성을 결정한다. 그러나 현재까지 무기물층과 유기매트릭스사이에 구조적 관계가 명확하게 밝혀지지 않았다. 왜냐하면 결정내부 단백질은 하나의 펩티드에서 2-7가지의 펩티드가 혼합된 매우 복잡한 폴리펩티드의 조성형태를 지니고 있으며 폴리펩티드 조성차이와 분석과정에서 단백질 응집, 손실에 대한 비교 분석이 어렵기 때문이다. 본 연구에서는 패각의 구조와 형태 형성에 미치는 유기 매트릭스를 분리정제하여 거대분자들과 탄산칼슘에 함침되어 복합재를 이루었을 때의 표면페텐셜 특성에 미치는 영향을 고찰하였다. 탄산칼슘의 반응성은 표면전하에 크게 의존하며 ,곧 이것은 전기이동도와 계면 전동 전위에 의존하게 된다. 콜로이드의 많은 특성은 입자의 전하에 의해 결정되며 이온의 흡착은 전하 전위의 분포와 기여에 의해 결정된다. 그리고 전위의 분포는 입자 사이 에너지 상호작용을 결정해서 콜로이드 물질의 적절한 응집과 분산을 야기하며 이때 제타전위를 사용하게 된다. 본 연구에서는 합성 탄산칼슘에 유기 매트릭스를 흡착하여 천연패각과 제타 전위를 비교함으로서 유기 매트릭스와 무기물사이의 상관관계를 고찰하려고 한다.

실험

materials

패각을 wire brush로 세척한 후 5% 수산화나트륨 용액에 72시간 함침하고 증류수로 세척하여 표면의 흙, 기타 유기물질등을 제거하였다. 완전 건조시킨 후 microgrinder를 이용하여 패각의 바깥층과 눈알층을 분리하고 습식처리를 이용하여 중간층과 안층을 분리하였다. 50ml 증류수와 투석하고자 시료를 혼합한 투석액을 3% 아세트산을 이용하여 soluble matrix을 분리하고 침전물을 5% 수산화나트륨에 1시간정도 처리하여 insoluble matrix와 chitin을 분리할 수 있었다.

흡착실험

결정내부 단백질을 탄산칼슘에 흡착시킬 때 흡착평형에 이르는 시간을 알아보기 위해 비이커에 합성한 탄산칼슘과 단백질을 혼합하여 만든 100ml 수용액을 교반시켰다. 5분마다 4ml씩의 시료를 추출하여 원심분리하여 흡착된 단백질을 포함한 탄산칼슘은 침전시키고 위의 상층액의 단백질 농도를 UV(280nm)를 이용하여 측정하였다. 또한 단위면적당 흡착량을 알아보기 위해 탄산칼슘의 비표면적을 BET를 사용하여 측정하였다.

FT-TR spectroscopy

단백질의 흡착여부를 알아보기 위해서 위에서 원심분리하여 분리한 흡착된 탄산칼슘을 물로 약하게 세척하여 건조한 후 FT-IR을 측정하였다.

흡착에 따른 zeta potential 측정

생물기원 탄산칼슘과 비생물적 탄산칼슘의 제타전위를 비교하기 위해 calcite (SIGMA)와 50도 이상에서 합성한 aragonite 의 제타전위를 측정하였다. 또한 결정내부 단백질의 표면 퍼텐셜을 알아보기 위해서 안층과 중간층 그리고 바깥층의 가용성 단백질과 경질단백질을 일정한 농도에서 pH를 변화시켜가며 제타전위를 측정하였다. 결정내부 단백질이 제타전위에 미치는 영향을 알아보기 위해 0.1g 의 calcite를 함유하는 수용액에 각층에서 추출한 결정내부 단백질을 일정 농도 넣고 흡착평형에 도달할 때까지 교반하였다. 그후 12시간동안 분산시킨 후 상층액의 제타전위를 측정하였다.

결과 및 고찰

분리 정제된 insoluble matrix를 첨가제로 사용하였을 때 흡착 경과는 각 층별로 40-50분에서 흡착량이 더 이상 증가하지 않고 일정한 값을 나타내는 경향을 보였으며 □overshoot'되는 모습을 나타내지 않았다. 이렇게 단 시간에 흡착이 이루어지는 것은 pore 표면적이 전체 BET 표면적에 비해 1%미만으로 pore 확산저항이 매우 작은 것에 기인한다고 유추할 수 있다. 단백질의 흡착량은 각층별로 다른값을 보였으나 흡착 평형에 도달하는 시간은 비슷한 것으로 보아 흡착에 걸리는 시간은 단백질의 조성이나 구조에 크게 영향을 받지 않는 것으로 보인다.

흡착을 확인하기 위해서 soluble matrix와 insoluble matrix이 흡착되었다고 생각되어지는 탄산칼슘의 FT-IR spectrum을 얻은 결과 calcite 특정피크와 함께 NH-bond 의 특정피크가 나타난 것으로 미루어 단백질이 무기질의 pore에 흡착되었음을 알 수 있다.

정상패각과 변형패각에서 분리된 각 층의 zeta 전위를 측정해 보면 주어진 모든 pH영역에서 모두 음의 전하를 가졌다. 이것은 합성된 방해석과 다른 결과를 나타내는 것이다. 전체적으로 모든 영역에서 음 값을 가진다는 것은 산성아미노산의 함량 때문으로 판단된다. 또한 pH가 증가하면 용액내의 OH-의 이온 세기가 증가하고 따라서 이중층의 압축이 일어나기 때문에 제타 전위가 감소하는 것으로 판단된다. 입자의 반응성을 의미하는 제타 전위의 변화폭은 정상패각보다 변형패각이 더 큰 것을 보아 더 불안하다고 할 수 있다. 생체복합체의 안정성은 결정내부단백질의 조성, 입체구조와 내포 상태에 의존한다고 할 수 있는데 결정내부 단백질은 여러 가지 조성의 아미노산으로 이루어졌지만 표면에서 이온화반응에 참가하는 아미노산, 즉 전하를 가질 수 있는 아미노산은 [eqn: { COO}^{- }]와 [eqn: { NH}^{3+ }]뿐이다. 패각내에서는 산성 아미노산조성이 우세한 함량을 보이므로 탄산칼슘입자와 결정내부단백질사이에서 음의 제타전위가 우세할 것으로 판단된다. 결정내부 단백질이 흡착 평형에 도달하는 것은 흡착량의 변화가 거의 없는 50분 후로 결정하였으며 이때 합성하는 탄산칼슘의 제타전위를 측정한 결과 pH를 변화시켜가며 측정하였으나 등전점은 측정되지 않았다. 이것은 단백질을 첨가하지 않은 실험과 상이한 것으로 위에서 언급한 산성아미노산의 많은 함량에 기인한다고 판단된다. 수용액상에서의 zeta 전위의 형성은 결정내부단백질이 갖는 아미노산의 조성과 입체구조의 특성이 좌우할 것이라고 판단된다.

결정내부 단백질의 2차구조를 고려하였을 때 흡착실험에서 나타난 제타전위의 변화는 수소결합이 만드는 안정한 [eqn: beta]-sheet 구조와 수소결합이 안정하지 않아 상대적으로 쉽게 동요되는 [eqn: alpha]-helical 구조의 함량차이로 설명 할 수 있다. 즉, 정상패각에서 안정한 [eqn: beta]-structure 가 상대적으로 적고, 불안정한 [eqn: alpha]-structure 의 함유량이 우세했고 따라서 제타전위의 변화 폭이 상대적으로 컸다. 이러한 경향은 단백질이 흡착된 탄산칼슘에서도 마찬가지였으며 따라서 단백질을 흡착한 무기질의 표면 포텐셜은 흡착된 기질의 특성에 좌우된다고 볼 수 있다. 또한 단백질 2차 구조와 흡착량을 비교해보면 대체적으로  [eqn: beta]-structure의 조성이 유세한 단백질에서 상대적으로 많은 양이 흡착되었음을 알 수 있었다. 이는 단백질의 구조에 따른 면적이 나선 모양인 [eqn: alpha]-helical구조보다 [eqn: beta]-structure 가 상대적으로 큰 것으로 기인한다고 볼 수 있다.

합성한 탄산칼슘과 참굴패각 각층, 또는 각층에서 추출한 단백질을 흡착시킨 탄산칼슘의 제타전위를 측정한 결과 패각의 제타전위는 합성탄산칼슘과 전혀 다른 전하의 분포를 보이며 정상패각보다 변형패각의 입자표면이 상대적으로 불안정하였다. 또한 아미노산 조성 분석 결과 상대적으로 산성 아미노산이 우월한 함량을 보이므로 전체적으로 모든 pH영역에서 음의 제타전위를 갖는 것으로 판단된다.

각각의 층 패각에서 추출하여 수용액상에 존재하는 결정내부단백질의 2차구조와 아미노산 함량을 정량화한 결과로 미루어 보아 흡착 실험에서 나타난 제타전위의 변화는 [eqn: beta]-sheet구조와 [eqn: alpha]-helical 구조의 2차구조와 양전하를 가지는 염기성 아미노산과 음전하를 가지는 산성 아미노산의 함량차로 설명될 수 있다. 따라서 본 실험을 통해 생체복합재 표면의 안정성과 퍼텐셜을 결정내부 단백질의 조성과 입체구조의 특성에 의존한다고 볼 수 있다.

제타전위와 같은 물질의 표면 상태와 생체환경 하에서의 재료의 표면구조변화와의 관계를 밝히는 것은 패각의 형성과정은 물론 새로운 생체재료의 합성에도 중요한 인자가 될 것으로 앞으로 많은 연구가 필요할 것이다.

참고문헌

Gadalrta SJ,  Camacho NP,  Mendelsohn R,  Boshey AL , Calcif.tissue Int. 1996,58,17-23

Scope R. K. Protein Purification ,3th ed. 46-48

Liu H. S.,Wang Y.C.,Chen W.Y., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,1995,5,25-34