T.reesei Cellulase 에 의한 제지 Sludge 가수분해

이원식, 류근갑

울산대학교 화학공학부

Hydrolysis of the Sludge from Paper & Pulp Industry

by T. reesei Cellulase

Won-Sik Lee, Keun-Garp Ryu

School of Chemical Engineering, University of Ulsan

서론

Lactic acid는 식품, 의약, 유기화합물의 원료로 광범위하게 사용되고 있으며, 최근에는 Lactic acid가 가지는 구조적 특성으로, 다양한 물리적, 화학적 성질을 지닌 생분해성 및 생체활성 고분자 등의 원료로 그 활용도가 크게 증가되고 있다.(1)

현재 Lactic acid의 제조는 미생물 발효 혹은 화학적 합성방법을 사용하고 있으며, 세계 총 생산량의 50%이상이 미생물 발효방법으로 제조되고 있다. 미생물 발효방법은 환경오염문제를 일으키는 섬유성 바이오 매스를 원료로 사용한다는 점에서 화학적 합성법과는 달리 청정기술이라는 점과 Lactic acid의 생산 원가를 낮추는 장점을 가지고 있다.(2)

섬유성 바이오매스 자원은 농산 및 임산 폐기물, 펄프 및 제지공정 슬러지, 폐지 신문, 각종 고체 쓰레기 등으로 다양하고 값싸게 구할 수 있으며, 이로부터 생산될 수 있는 생물공학제품은 연료용 알코올, 식품, 및 유기화학제품 등으로 다양하다.(3) 섬유성 바이오 매스로부터 Lactic acid를 생산하기 위해서는 먼저 cellulose를 효소가수분해하여 glucose로 전환시키고, 다음으로 glucose를 발효시켜 Lactic acid를 제조하는 두 단계로 나뉘어진다.(4)

본 연구에서는 cellulose를 glucose로 효소가수분해하는 공정에서 Washing & Filtering의 전처리 공정을 이용하여 원료 sludge의 당전환율을 높이는 실험을 실시 하였다. 그리고 효소반응전에 sludge를 해리시킴으로써 당전환율에 미치는 영향에 대해서도 실험을 실시하였다.

재료 및 방법

·효소 및 Sludge

T. reesei cellulase(Crude)효소, 활성은 CMC activity가 12.06unit/mg이고,  Avicel activity가 0.66unit/mg(Unit: □ol glucose unit produced/min)이다. CMC반응은 1%(1g CMC/100ml buffer)로 50℃에서 30min간, Avicel 반응은 1%(20mg Avicel/2ml buffer)로 50℃에서 120min간 항온조에서 교반하면서 반응하였다. 사용된 buffer는 50mM, Sodium acetate, pH-5이다.

실험에 사용된 sludge는 (주)삼화제지의 Pulp sludge이다.

·Sludge 전처리

Washing은 50ml 원심분리 tube에 30ml buffer(50mM, Sodium acetate, pH 5)와 3.44g sludge를 투입하여 10min간 원심분리한 다음 여액을 폐기하는 방법으로 3회 반복하였으며, Filtering은 Filter(Buchner type funnel with fritted disc)를 이용하여 진공하에서 Wet sludge를 1hr동안 Filtration하였다.

·실험방법

100ml 삼각플라스크에 전처리를 하지 않은 Original sludge는 3.44g, Washi-

ng & Filtered sludge는 2.16g(Dry weight 기준 consistency 2%)을 50ml buffer

(50mM, Sodium acetate, pH 5)와 함께 투입하여 완전 해리시킨 경우와 해리하지 않은 경우 두가지로 하여 실험을 실시하였다. sampling은 Time=0에서 600□를 하고서 T.reesei cellulase를 투입하여 50℃, 항온조에서 교반하면서 효소반응을 시킨다. 효소반응 중에 Time= 0.5, 1, 2, 3, 6, 12hr에서 600□씩을 sampling하여 분석하였다.

·분석

분석은 DNS test방법을 이용하였다. DNS시약은 D-nitrosalycilic acid 1g, Phenol 0.2g, Sodium sulfite 0.05g과 Rochelle salt(Sodium Potassium Tartrate) 20g을 2%의 NaOH용액(1g NaOH/ 50ml Distillation Water)에 용해시킨 다음 total 100ml가 되도록 2차 증류수로 희석한다. 분석방법은 DNS시약 1.5ml, Glucose Standard(20mg glucose/100ml 증류수) 0.3ml과 원심분리한 sludge의 효소반응여액 0.55ml로 total 2.35ml로 하여 100℃, 끓는 물에 5min간 끓여 효소활성을 없앤 다음 냉각시킨후 Abs.540nm에서 DiodeArraySpectrophotometer(8452-

A, HEWLETT PACKARD)를 이용하여 분석하였다.

결과 및 고찰

T. reesei cellulase를 이용한 Pulp sludge의 효소가수분해 실험에서 해리와 Washing & Filtering이 cellulose의 당전환율에 미치는 영향을 조사하였다. 사용한 Pulp sludge의 성분은 [Table 1]과 같다. [Table 1]에서 Fixed Solid와 Volatile Solid의 %는 Dry weight 기준이다. Fixed solid는 건조시킨 sludge를 550℃, 전기오븐에서 2.5hr동안 건조시키고 무게를 측정하였으며, Ash는 Fixed solid를 1000℃, 전기오븐에서 4hr동안 태우고서 무게를 측정하였다.

Table 1. Analysis for Pulp sludge

	Original Sludge		Washing & Filtered Sludge
	g	%	g	%
Wet	2.010	100	2.003	100
Dry	0.584	29.0	0.846	42.2
Fixed Solid	0.224	63.0	0.318	37.6
Volatile Solid	0.360	37.0	0.528	62.4
Ash	0.169	39.5	0.263	31.1

[Fig 1]은 T.reesei cellulase의 양을 30mg으로 하고서 전처리를 했을 경우와 그렇지 않은 경우에 대해 시간대별로 당전환율을 보이고 있다. 대부분의 반응은 반응 시작 후 3시간 이내에 이루어지며 이후로는 당전환율이 거의 일정함을 보이고 있다. 전처리를 한 경우 dry sludge 1g 당 glucose 생성량이 180mg 정도를 보이고 있으며, 전처리를 하지 않은 경우는 dry sludge 1g당 glucose 생성량이 100mg정도를 보임으로써 당전환율이 전처리를 한 경우가 하지 않은 경우의 2배 정도를 보이고 있다. [Fig 2]는 T.reesei cellulase의 양을 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50mg으로 변화시키면서 반응시간에 상관없이 당전환율이 최대인 점을 그림으로 표현한 것이다. 그림에서 사용하는 T.reesei cellulase의 양이 증가하면서 당전환율이 향상됨을 보이고 있으며, 전처리를 한 경우와 하지 않은 경우의 당전환율 차이도 증가함을 보이고 있다.

[Fig 3]에서는 전처리를 한 sludge에서 12hr 동안 해리를 한 경우와 하지 않은 경우에서 당전환율의 차이를 보이고 있다. 해리를 한 경우 dry sludge 1g당 180mg의 glucose가 생성되지만, 해리를 하지 않은 경우 dry sludge 1g당 100mg정도의 glucose가 생성됨을 알 수 있다. 우리는 이번 실험으로 당화과정에서

효소를 사용하면 cellulose의 당전환율이 증가함을 알 수 있지만 T.reesei cellulase가 고가여서 비용부담이 증가함으로 타당한 방법은 아니다. 이를 해리, Washing 그리고 Filtering 등의 간단한 전처리과정을 거침으로써 당전환율을 높일 수 있음을 확인하였다. 이번의 실험은 여러 연구에서 이미 밝혀놓은 T.reesei cellulase의 반응 최적조건인 50℃, pH-5 완충용액(50mM, Sodium acetate)에서 실시하였다. 차후로 반응 온도와 pH, 그리고 sludge의 Consistency를 변화시킴으로써 당전환율의 변화를 조사할 필요성이 있다.

참고문헌

1. Litchfield, J. H., Appl. Microbial, 42, 45∼96 (1996)

2. Lewis, P.V., AND Yang, S., Biotechnol. Prog., 8, 104 (1992)

3. Parajo, J. C., J. L. Alonso, and V. Santos(1996), Lactic Acid from Wood,          Proc. Biochem., 31, 271∼280

4. Takagi, M., Abe, S., Suzuki, S., Emert, G. H., and Yata, N.(1977), in Proc,        Bioconversion Symposium, ⅡT, Delhi, Ghose, T. K., ed., 551

5. Duff, S. J. B and W. D. Murry (1996), Bioconversion of Forest Products          Industry Waste Cellulosics to Fuel Kong, C. B., Cellulose Conversion to        Latic Acid