커들란 분리공정 개발

박재억, 장정균, 이중헌

조선대학교, 화학공학과

Development of Curdlan Separation Process

Jea-Eug Park, Chung-Kyun Chang, Jung-Heon Lee

Department of Chemical Engineering, Chosun University

서론

미생물에 의하여 생산되는 다당(polysaccharide)은 생산균주와 배양방법등에 따라 분자량, 구성당의 종류, 결합순서, 결합양식, 결합위치 및 가지(branch)유무 등에 위해 gel 형성능, 유화안정성, 표면장력 조절능, 물흡수능, 접착능, 윤활능 및 필름형성능 등의 광범위한 특성을 갖는 다당이 생성되어지고 있다. 따라서 미생물이 생산하는 다당은 식품, 화장품, 석유산업, 제지공업, 및 의약품 등 각종 산업의 중요한 소재로 사용되어 왔으며, 최근에는 콘크리트 구조강화제로서의 용도로 개발되었다(1). 대표적인 다당 및 생산 균주는 xanthan(Xanthomona campestis), chitosan(Mucor, Rhizopus, Phycomyces) pullulan(Aureobasidium pullulans), gellan(Pseudomonas elodea), curdlan(Agrobacterium radiobacter, Alcaligens faecalis), dextran(Lactobacillus spp), 및 welan(Alcaligens spp.)등이 있다(2).

Curdlan은 □-1,3 glucose로 연결된 단일고분자로서 물에 불용성이며 Agrobacterium sp.와 Alcaligenes faecalis 균주에 의해 배지내에 탄소원이 충분히 존재하며 질소원이 고갈되었을 때 curdlan 생합성이 일어난다. 1962년 Harada와 그의 동료들에 의해 처음 발견된 이래로 그들의 특이한 물성 특히, 액상에서는 가열에 의해 탄력성 있는 비가역적인 gel을 형성하는 특징이 있기에 식품분야와 비 식품분야에서 많은 관심을 기울여 왔다. 이러한 curdlan의 잠재적 이용가능성 때문에 생산공정과 관련된 화학적 물리적 특성연구는 많이 수행되어 왔으나 curdlan의 분리공정에 관한 연구결과는 많지 않다.

curdlan을 미생물 배양액으로부터 분리하는 공정은 여러 단계로 구성된다. 배양액을 원심분리하여 cell와 curdlan을 회수하여 NaOH 용액을 첨가하여 curdlan을 녹인다. 이 용액을 원심분리 함으로써 cell와 curdlan을 분리하여 상등액을 회수하고, 이 용액에 HCl을 첨가하여 중화 시켜 원심분리하면 curdlan이 회수된다. 분리된 curdlan은 물을 첨가하여 세척함으로써 순수한 curdlan이 회수가 가능하다. 이러한 기존의 curdlan 분리공정은 원심분리에 따른 에너지가 많이 사용되며 산이나 염기를 사용하므로 공정 후의 폐수처리에도 비용이 많이 든다.

본 연구는 생산된 배양액을 알칼리 처리를 하지 않고 curdlan을 분리하는 방법에 관한 연구이다. curdlan 분리공정에서 cell과 curdlan을 알칼리 처리를 하지 않고 분리가 가능하다면 에너지 사용 및 폐수처리에 많은 비용을 절감 할 수 있다. 본 연구에서는 Agrobacterium sp. 의해 생산된 curdlan을 포함하는 배양액을 사용하였다.

실험방법

본 실험에 사용된 배양액은 Agrobacterium sp. 를 사용하여 종배양 배지에서 30℃에서 17시간 동안 배양한 배양액을 사용하였다. 여기서 생산되는 다당은 curdlan 이며, 액체의 밀도차를 이용하기 위해 사용한 액체는 설탕용액이다. 설탕은 대한설탕의 가는 정백당을 사용하였으며, 원심분리를 위한 원심분리기는 vision 과학의 VS-15CF를 사용하였다. 그리고 sonication을 위해 Artex사의 Artex300을 사용하였다. 원심분리 tube는 미국 CORNING사의 50 ml Falcon tube를 사용하였다.

(1) 배양액(curdlan + cell) 과 설탕의 농도는 100g/l

Case 1. 배양액(curdlan + cell) 와 설탕용액(100g/l)을 같은 비율로 설탕용액을 먼저 넣은 뒤 배양액을 넣고 5000rpm × 10min에서 원심분리 하였다.

Case 2. 배양액(curdlan + cell) 와 설탕용액(100g/l)을 같은 비율로 섞은 뒤에 혼합하여 5000rpm × 15min에서 원심분리 하였다.

Case 3. 배양액(curdlan + cell) 와 설탕용액(100g/l)을 같은 비율로 배양액을 먼저 넣은 뒤 설탕용액을 넣고 5000rpm × 10min에서 원심분리 하였다.

(2) 위와 같은 3가지 방법으로 설탕의 농도를 200g/l, 300g/l, 400g/l, 500g/l에 대하여 반복 실험하였다.

(3) 배양액으로부터 25ml을 취하여 cell을 sonication 하고 난 후 설탕농도가 400g/l인 용액을 먼저 centrifuge tube에 넣고 sonication한 배양액을 넣고 5000rpm × 10min 원심분리 하였다.

(4) 비교를 위해 일반적인 curdlan 분리방법을 사용하여 curdlan을 분리하였다.

배양액을 원심분리(5000rpm×15min) 한다 → 상등액을 제거하고 침전물을 NaOH(1N)에 녹인다 →NaOH(1N)에 녹은 침전물을 원심분리(5000rpm×10min)한다→원심분리 된 것 중 침전물은 cell이며 상등액은 curdlan이므로 상등액을 취하여 HCl(1N)로 중화한다→다시 중화한 것을 원심분리 한다→상층은 제거하고 하층을 3차례이상 세척한다.

결과 및 토론

본 실험결과 curdlan을 포함하는 배양액은 밀도가 1.12g/ml이상에서는 cell층과 curdlan층이 분리되는 것을 관찰 할 수 있었다. 그러나 층의 분리가 현저하게 일어나는 밀도는 적어도 1.15g/ml이상 되어야 한다. 또한 특이한 점은  설탕용액을 먼저 넣고 원심분리를 할 때에는 층이 나누어지는 것을 관찰 할 수 있으나, 배양액을 먼저 넣거나, 혼합을 한 후에 원심분리 했을 경우에는 층이 나누어지는 것을 관찰 할 수 없었다. 이는 짙은 농도의 설탕용액이 배양액과 섞이어 분리에 필요한 밀도인 1.12 g/ml 보다 작아지기 때문이다.

Table 1. Density of Sucrose Solution and Curdlan Separation

Sugar Concentration [ g/l ]	Density [ g/ml ]	Curdlan separation
		Case 1	Case 2	Case 3
100	1.04	×	×	×
200	1.08	×	×	×
300	1.12	○	×	×
400	1.15	○	×	×
500	1.19	○	×	×

Case 2 및 Case 3 실험에서의 결과에서 볼 수 있듯이 밀도 차를 위한 방법에서 두 액상이 섞이지 않는 것이 바람직하므로 밀도가 1.2 g/ml 정도인 유기용매를 사용하는 것이 좋다. 이러한 유기용매의 사용은 층을 명확히 구분하여 curdlan을 회수하는 비용을 줄일 수 있을 것이다. 단 유기용매의 사용에 있어서 독성이 적은 것과 melting point가 낮은 것 그리고 물과 잘 섞이지 않는 유기용매를 사용 하여야 한다.

결과

curdlan을 분리하는 공정은 실험항의 (5)에서도 보았던 것처럼 많은 단계의 공정이 소요된다. 이러한 공정을 단축화 시키기 위해서 본 연구를 시작하게 되었으며, 다음과 같은 결과를 어떻게 되었다. 첫째로 curdlan을 배양한 배양액을 밀도차를 이용하여 curdlan과 cell을 분리 할 수 있었다. 그 밀도는 약1.12∼1.15g/ml 이다. 밀도가 1.12g/ml이하이면 curdlan과 cell모두 원심분리하면 밑으로 가라앉는다. 그리고 밀도가 1.15g/ml 이상에서는 curdlan과 cell모두 원심분리하면 위로 올라간다. 그러므로 밀도가 약1.12∼1.15g/ml이면 curdlan과 cell을 분리 할 수 있다. 그러나 한가지 단점은 기존의 공정에 의해서 얻어지는 것 만큼의curdlan을 얻지 못한다는 것이다. 앞으로의 연구에서 이러한 단점을 보안하고, 설탕용액 대신에 유기용매를 사용하여 curdlan과 cell을 분리 할 수 있는 공정을 개발 할 것이다.

참고문헌

1. Lee JH, Lee IY, Kim MK, Park YH, Optimal pH control of batch processes for production of curdlan by Agrobacterium species, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 23:143-148, 1999.1.

2. 이재훈, 미생물 다당류의 다양성과 산업적 이용 및 전망, 한국산업미생물학회,생물산업(Bioindustry news), 8, 4, 4033-4043, 1995

3. Renn DW, Purified Curdlan and its Hydroxyalkyl Derivatives-Preparation, Properties and Applications, Carbohydrate Polymers, 33: 1997.